婴幼儿配方奶粉中核苷酸含量测定

文/苑向杰 李则均＊

（黑龙江省完达山乳品股份有限公司）

婴幼儿配方奶粉中核苷酸含量测定

文/苑向杰 李则均＊

（黑龙江省完达山乳品股份有限公司）

以 GB 5413.40-2016《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定》为参考，采用SUPELCO LC-18-T液相色谱柱测定核苷酸。试验调整了流动相比例，在检测波长为254 nm时，核苷酸5 个组分目标峰与配方奶粉中杂质完全分开，分离效果良好。5 种核苷酸浓度在1.00～10.00 μg/mL范围内与其目标峰面积呈良好的线性关系（R2≥0.99）。通过试验重现性和回收率试验等数据证明本方法稳定可靠，前处理操作简单，适合婴幼儿配方奶粉厂家推广使用。

婴幼儿配方奶粉；核苷酸；高效液相色谱-紫外检测法

核苷酸是一类由嘌呤碱或嘧啶碱、核糖或脱氧核糖以及磷酸三种物质组成的化合物。核苷酸具有许多重要生物学功能，是生物体内重要的低分子化合物。母乳中核苷酸含量很高，为72 mg/L。婴幼儿配方奶粉中添加核苷酸能维持婴儿正常肠道功能，减少腹泻，提高免疫力等。核苷酸的测定方法主要包括质谱法、色谱质谱法、毛细管电泳-质谱法等，本文采用高效液相色谱法。主要测定游离核苷酸总量，包括胞嘧啶核苷酸（CMP）、尿嘧啶核苷酸（UMP）、次黄嘌呤核苷酸（IMP）、鸟嘌呤核苷酸（GMP）、腺嘌呤核苷酸（AMP）。本方法样品前处理简便快速，有效减少核苷酸损失，采用SUPELCO LC-18-T色谱柱进行分离，5 种组分分离彻底，基线稳定。

1 材料方法

1.1 仪器与药品标准品

1.1.1 仪器

高效液相色谱：配UV/VIS紫外检测器，美国PE生产；

数控超声波清洗器：K Q-1000DB，昆山市超声仪器有限公司；

pH计：MP220，METTLER TOLEDO生产；

涡旋振荡器：GENIUS 3，IKA VORTEX生产。

1.1.2 药品

超纯水：Millipore纯水机制备；

冰乙酸：科密欧生产，分析纯，100 mL/L；

四丁基硫酸氢铵：CNW生产，色谱纯；

甲醇：DiKMA生产，色谱纯；

磷酸氢二钾：科密欧生产，分析纯，0.1 mol/L；

磷酸：科密欧生产，分析纯；

磷酸盐缓冲溶液（1.40 mol/L四丁基硫酸氢铵，0.01 mol/L磷酸二氢钾）：称取1.360 g磷酸二氢钾，加 0.4753 g四丁基硫酸氢铵，用900 mL水溶解，用磷酸氢二钾调pH值至3.2，加水定容至1 000 mL，一周内使用。

1.1.3 核苷酸标准品及配制

胞嘧啶核苷酸（CMP）、腺嘌呤核苷酸（AMP）、尿嘧啶核苷酸（UMP）、鸟嘌呤核苷酸（GMP）纯度、次黄嘌呤核苷酸（IMP），纯度≥99%，SIGMA生产。

标准液配制：分别称取核苷酸标准品CMP、AMP、UMP、GMP和IMP各10 mg，用超纯水溶解并定容至100 mL容量瓶中。校正各组分水分和钠盐含量，以酸型计，各组分折算系数见表1。

1.2 预处理方法

称取不含淀粉的婴幼儿配方奶粉5.0000 g，加入20 mL热水（50～60 ℃）充分溶解，冷却至室温，用醋酸溶液调节试样pH值为4.1，移入50 mL容量瓶定容，12.5 cm定量滤纸过滤，所得滤液用0.45 μm微孔过滤备用。

表1 核苷酸校正水分和钠盐含量折算系数

1.3 分离条件

色谱柱：SUPELCO LC-18-T，5 μm，250 mm×4.6 mm；

流动相：磷酸盐缓冲液+甲醇=（1000+25）mL；

流速：1 mL/min；

进样量：10 μL；

检测波长：254 nm；

柱温：25 ℃。

图1-1 浓度为10 μg/ mL的CMP色谱图

图1-2 浓度为10 μg/ mL的AMP色谱图

2 结果分析

2.1 婴幼儿配方奶粉中核苷酸目标峰的确定

核苷酸检测主要有5 个组分，分别为胞嘧啶核苷酸（CMP）、腺嘌呤核苷酸（AMP）、尿嘧啶核苷酸（UMP）、鸟嘌呤核苷酸（GMP）、次黄嘌呤核苷酸（IMP）。5 个单一组分标准品色谱图见图1-1～1-5，5 个组分混合标准液色谱图见图2。

通过分析图1-1～1-5，各单一组分目标峰出峰时间分别为：CMP 3.608 min，AMP 13.100 min，UMP 14.948 min，GMP 18.603 min，IMP 23.036 min。图2中可以看出，核苷酸混合标准液各组分目标峰相互间没有试剂峰干扰，具有很好的相应强度，分离效果明显，基线稳定。

图3为婴幼儿配方奶粉中核苷酸色谱图，奶粉加标后可以确定，图3中的5 个目标峰即为需要的色谱峰。婴幼儿配方奶粉成分复杂，样品预处理去除大量酪蛋白后，CMP、AMP、UMP、GMP、IMP 5 个组分目标峰分离彻底，灵敏度高，无干扰杂峰。

图1-3 浓度为10 μg/ mL的UMP色谱图

图1-4 浓度为5 μg/ mL的GMP色谱图

图1-5 浓度为5 μg/ mL的IMP色谱图

图2 核苷酸5 个组分混合标准液色谱图

图3 婴幼儿配方奶粉中核苷酸色谱图

2.2 标准曲线

以核苷酸5 个组分标准工作液的浓度为横坐标；CMP以不同浓度标准工作液注入高效液相色谱仪测定的对应峰高为纵坐标，AMP、UMP、GMP、IMP以不同浓度标准工作液注入高效液相色谱仪测定的对应峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。CMP不同浓度工作液与对应峰高见表 2-1，标准曲线见图 4-1。AMP、UMP、GMP、IMP不同浓度工作液与对应峰面积分别见表 2-2、2-3、2-4、2-5，标准曲线分别见图 4-2、4-3、4-4、4-5。

线性回归方程：CMP为y=2 194.9002x+1 136.4789，R2＞0.9990；AMP为y=38 156.9941x+38 199.4274，R2＞0.9969；UMP为y =21 598.3549x+41 572.7569，R2＞0.9934；GMP为y=39 652.7318x+28 655.5717，R2＞0.9980；IMP为y=29 986.7124x+26 814.7275，R2＞0.9958。说明核苷酸5 个组分工作液浓度在1.00～10.00 μg/mL时，核苷酸5 个组分峰面积（其中CMP为峰高）与质量浓度之间具有良好的线性关系。本方法定量限见表3。

2.3 方法的重现性与回收率

2.3.1 重现性

核苷酸5 个组分的测定叠加图见图5，样本量为6，定量重复性见表4。从图5和表4可以看出，采用此方法测定婴幼儿配方奶粉中核苷酸含量，试验重现性良好。

2.3.2 回收率试验

由于本文核苷酸五个组分成分复杂，在奶粉试样中添加已知量的被测组分，然后进行测定，检查被加入的五个核苷酸组分能否定量回收。本文选取没有添加过核苷酸的全脂奶粉做空白，根据核苷酸五组分曲线浓度范围1.00～10.00μg/mL，加标回收试验分别添加核苷酸五组分含量为10mg/100g、20mg/100g、30 mg/100 g的三组进行试验，测得回收率结果见表5。

添加水平为10mg/100g时，加标回收率较低，平均值为89.3%；添加水平为20mg/100 g时，加标回收率平均值为91.9%；添加水平为30mg/100g的加标回收率较高，平均值为93.1%。核苷酸5 个组分易水解，这就增大了加标回收的测定难度，因此加标标准品要现用现配。结果显示此方法加标回收效果良好。

表2-1 CMP标准工作液液浓度与对应峰高

表2-2 AMP标准工作液液浓度与对应峰面积

表2-3 UMP标准工作液液浓度与对应峰面积

表2-4 GMP标准工作液液浓度与对应峰面积

表2-5 IMP标准工作液液浓度与对应峰面积

图4-1 CMP标准曲线

图4-2 AMP标准曲线

图4-3 UMP标准曲线

图4-4 GMP标准曲线

3 讨论

核苷酸需要测定5 个组分（CMP、AMP、UMP、GMP、IMP），蛋白类成分特别容易分解，标准样品要现用现配，测定时柱温箱温度要严格控制在20～25 ℃。每次测定的样品数量不能过多，样品预处理液在室温存放6～8 个小时后就会逐渐分解，导致测定结果偏低，或无法检测到全部组分。样品预处理液要在8 个小时内全部测定完毕。

图4-5 IMP标准曲线

图5 核苷酸的重复试验叠加图

表3 核苷酸5 个组分定量限

表4 婴幼儿配方奶粉中核苷酸5 个组分定性定量重复性结果表

表5 核苷酸5 个组分回收率试验

核苷酸组分复杂，对流动相有很高的要求，流动相的pH值和缓冲盐含量都对分离效果起到决定性影响。流动相的pH值和缓冲盐含量稍微变化都会导致CMP目标峰不能彻底分离。CMP含量占核苷酸总添加量的40%左右，是计算核苷酸总量是否合格的主要依据，CMP分离不彻底，或者数值偏低，直接导致产品核苷酸含量不合格。当CMP分离不彻底时，需要在线测定流动相的pH值，适当添加缓冲盐或者稀磷酸，调节pH值到3.2，保证CMP充分分离。

本文依据GB 5413.40-2016《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定》方法，采用高效液相色谱法测定婴幼儿配方奶粉中核苷酸含量，通过多个厂家多个型号色谱柱的对比，选用SUPELCO LC-18-T型号色谱柱，核苷酸5 个组分分离效果明显。本方法前处理操作简单，定量准确，适合批量测定。

[1] 田燕，张凤霞，贾迪，等. 高效液相色谱法测定乳制品中核苷酸含量[J]. 中国食品添加剂，2014（4）：138-143.

[2] 张婷婷，曾明飞，金燕，等. 反高效液相色谱-串联质谱法测定母乳及奶粉中核苷和核苷酸含量[J]. 分析化学，2014，42（4）：585-591.

[3] 俞莎，陈晓春，潘洪峰，等. UPLC-MS/MS法测定婴幼儿配方奶粉中五种核苷酸研究[J].营养学报，2010，32（2）：187-189.

[4] 赵贺华，刘晓红. 核苷酸对婴幼儿免疫系统的影响[J]. 中国临床医生，2014（8）：12-14.

[5] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 5413.40-2016食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定[S]. 北京：中国标准出版社，2017.

Determination of Nucleotide Content in Infant Formula Milk Powder

YUAN Xiang-jie，LI Ze-jun＊
（Heilongjiang Wondersun Dairy Co.，Ltd）

Based on GB 5413.40-2016“National Food Safety Standards Determination of Nucleotide in Infant Food and Milk products”as the reference，SUPELCO LC-18-T liquid chromatographic was used to determine the nucleotide content. The proportion of mobile phase was adjusted. When the detection wavelength was 254 nm，the target peaks of fi ve components of nucleotide were completely separated from the impurities in the formula milk powder and the separation effect was good. Five nucleotide concentrations ranged from 1.00 to 10.0 μg/mL and its target area showed a good linear relationship（R2≥0.99）. The experimental reproducibility and recovery test data have showed that the method is stable and reliable. Pre-treatment operation is simple， suitable for infant formula manufacturers to promote the use.

infant formula milk powder；nucleotide；high performance liquid chromatography-UV determination

苑向杰（1980-），女，助理工程师，主要从事乳品检测工作。

⋆通信作者：李则均（1983-），女，工程师，主要从事质量分析工作。

2017-08-24）