白细胞介素-17A及其受体与巨噬细胞在肠癌、肠炎和肠息肉组织中表达及意义

杨学良 孙雪梅 赵晓晖 杨万国 姜 静 沈维高 夏雪怡 刘艳波

(北华大学附属医院，吉林 吉林 132012)

慢性肠炎及肠息肉对直结肠癌的发生发挥重要作用，而炎症过程中聚集的炎细胞(如淋巴细胞、巨噬细胞、肥大细胞和中性粒细胞等)及其分泌的细胞因子与肠癌发生、发展关系密切，目前研究较多的是细胞因子白细胞介素(IL)-17相关家族，目前与肿瘤关系研究最为密切的是IL-17A及IL-17受体(R)A〔1,2〕。IL-17A主要由Th17细胞分泌，此外，血管内皮细胞，腺上皮细胞、巨噬细胞、肥大细胞和巨噬细胞等也可分泌，存在于多种炎症相关性肿瘤患者体内〔3，4〕。IL-17RA也主要由Th17细胞分泌，IL-17A与IL-17RA结合，通过一定的信号转导过程影响其下游基因的表达，然而在肠相关疾病中作用仍不明确。本研究探讨IL-17A、IL-17RA和巨噬细胞在肠癌、肠息肉和肠炎中组织的表达及意义。

1 材料与方法

1.1研究对象 本研究所用标本来自北华大学附属医院和吉林市人民医院。其中，肠炎15例，男11例，女4例，平均年龄(50±10.3)岁，肠息肉6例，男5例，女1例，平均年龄(55±13.4)岁，肠癌30例，男21例，女9例，平均年龄(60±14.5)岁。所有患者本人知情且有明确病理诊断，各项操作符合伦理学要求。

1.2主要仪器设备 显微镜(日本奥林巴斯公司)、软件处理图像系统(美国Image pro plus出品)、电子天平、磁力搅拌器、酸度计、移液器、电热鼓风干燥箱、灭菌锅、台式低速离心机等。

1.3主要试剂 实验中使用抗IL-17A(免抗IgG，1∶150)、抗IL-17RA(山羊抗IgG，1∶200)、抗CD68(鼠抗IgG，1∶800)抗体分别购自Novus biological(美国)、Abcam(香港)Ltd(中国)、Santa Cruz有限公司(美国)，二抗为北京中杉金桥试剂公司提供的通用型PV9000试剂盒和山羊抗PV9003试剂盒，二氨基联苯胺(DAB)显色液由北京中杉金桥试剂公司生产，其他均为进口及国产分析纯试剂。

1.4免疫组织化学染色法检测IL-17A、IL-17RA及巨噬细胞阳性表达情况 标本常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次，每次3 min，蒸馏水冲洗2次后待用；利用高温高压法修复抗原(修复液为pH6.0的0.01 mol/L柠檬酸缓冲液)，冷却至室温后PBS漂洗3次；1% H2O2灭活内源性过氧化物酶：滴加一抗常温孵育过夜，PBS漂洗3次，每次3 min；滴加二抗(辣根过氧化物酶标记，二抗加5%的血清),常温孵育30 min,PBS漂洗后DAB显色，自来水充分冲洗后，苏木素轻度复染，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，干燥，封片。当棕黄色颗粒高于本底时定义为阳性。在200倍显微镜下连续拍摄每一张组织切片，在相同条件下通过Image pro plus软件对图片进行平均光密度值分析。IL-17A和IL-17RA阳性计算方法为阳性面积占整个染色切片面积百分比。巨噬细胞浸润密度的计算方法为单位面积(mm2)阳性细胞的个数。

1.5统计学方法 采用Minitab Release9.2进行Mann-WhitneyU检验。

2 结 果

IL-17A阳性颗粒呈棕黄色，主要表达于肠腺上皮、间质内单个核细胞、血管内皮细胞及部分癌细胞中，见图1。IL-17A在肠炎、肠息肉及肠癌组织中阳性表达率分别为6.35%±0.54%、9.33%±0.47%和2.82%±0.16%。与肠癌组织相比，IL-17A在肠炎和肠息肉中阳性率明显增加(均P<0.01)；与肠炎组织相比，肠息肉中阳性率明显增高(P<0.01)。IL-17RA阳性颗粒亦呈现棕黄色，主要表达于腺上皮，间质内单个核细胞、血管内皮细胞及部分癌细胞内，见图2。IL-17RA在肠炎、肠息肉及肠癌组织中阳性表达率分别为4.65%±0.51%、5.03%±1.48%、2.12%±0.35%，与肠癌组织相比，肠炎及肠息肉中IL-17RA阳性表达率明显增高(均P<0.05)。CD68+(巨噬细胞标记物)细胞在肠炎、肠息肉及肠癌组织中主要浸润于间质，见图3，其浸润密度分别为(21.21±1.94)mm-2、(10.83±2.24)mm-2、(15.31±1.02)mm-2，三者间表达无明显差异(P>0.05)。肠癌组织中IL-17A的阳性表达与IL-17RA阳性表达呈正相关(r=0.844，P=0.000 1)；IL-17A阳性表达与巨噬细胞阳性表达呈正相关(r=0.621,P=0.000 1)；而IL-17RA阳性表达与巨噬细胞阳性表达也呈正相关(r=0.750,P=0.000 1)。

图1 IL-17A在肠相关疾病中的阳性表达(DAB，×200)

图2 IL-17RA在肠相关疾病中的阳性表达(DAB，×200)

图3 巨噬细胞在肠相关疾病中阳性表达(DAB，×200)

3 讨 论

IL-17A在卵巢癌、乳腺癌、肝癌和胃癌等肿瘤组织中有较高表达,且预后不良〔5,6〕。本研究证实IL-17A及IL-17RA在肠炎组织中表达明显增加，表明IL-17A及IL-17RA表达增加可引起炎症细胞浸润，而炎症细胞浸润又可释放细胞因子和炎症介质，通过趋化作用加强这一反应。这些炎症细胞可表达及分泌IL-17A家族，包括IL-17A及其受体IL-17RA，上述多种细胞因子作用于肠黏膜组织，使得肠相关细胞不正常增殖，甚至造成息肉及癌症的发生。本研究肠癌组织IL-17A及IL-17RA阳性表达较炎症及息肉组织明显降低，一方面可能是因为IL-17A及受体主要由由于淋巴细胞、巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞等分泌，在肠炎组织内，有大量炎症细胞浸润，使得IL-17A及受体IL-17RA的表达明显增加，另外，肠息肉主要由腺上皮的异常增生而发生，而IL-17A及IL-17RA也可由腺上皮细胞分泌，并且肠癌组织内正常的腺上皮细胞发生改变，因损伤或不正常的结构细胞产生IL-17A及IL-17RA会相应减少〔7〕。炎性微环境是肠道疾病的主要特征之一，可影响肠癌组织内的血管形成，一方面，在肿瘤微环境中存在不同程度的炎症，炎症可促进肿瘤细胞的增殖、迁徙和存活，另外，肿瘤微环境中的炎症反应是肿瘤组织内免疫反应的重要因素，可决定肿瘤组织内炎症的促瘤或抑瘤作用〔8〕。肿瘤微环境中的促炎症因子具有趋化炎症细胞的作用，如T淋巴细胞和巨噬细胞。本研究表明，CD68+巨噬细胞在肠炎及肠癌中浸润增加，表明其可能参与了肠炎及肠癌的发生及发展。巨噬细胞是炎症及肿瘤组织内最重要的组织部分，在肿瘤的发生发展中起着非常重要的作用〔9〕。根据肿瘤类型的不同，它的作用相当复杂，至今也未弄清。本研究表明巨噬细胞在肠癌及肠炎组织中浸润增加，且与IL-17A及IL-17RA阳性表达呈正相关，暗示IL-17A及IL-17RA可能主要由巨噬细胞分泌。巨噬细胞通过自分泌途径分泌IL-17A及IL-17RA，在肠癌发展中的作用需要深入研究。

1Pappu R,Ramirez-Carrozzi V,Sambandam A.The interleukin-17 cytokine family:critical players in host defence and inflammatory diseases〔J〕.Immunology,2011;134(1):8-16.

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3Zhu X,Mulcahy LA,Mohammed RA,etal.IL-17 expression by breast-cancer-associated macrophages:IL-17 promotes invasiveness of breast cancer cell lines〔J〕.Breast Cancer Res,2008;10(6):R95.

4Liu Y,Zhao XH,Sun XM,etal.Expression of IL-17A,E,and F and their receptors in human prostatic cancer:comparison with benign prostatic hyperplasia〔J〕.The Prostate,2015;75(16):1844-56.

5Ning C,Li YY,Wang Y,etal.Complement activation promotes colitis-associated carcinogenesis through activating intestinal IL-1beta/IL-17A axis〔J〕.Mucosal Immunol,2015;8(6):1275-84.

6Liao R,Sun J,Wu H,etal.High expression of IL-17 and IL-17RE associate with poor prognosis of hepatocellular carcinoma〔J〕.J Exp Clin Cancer Res,2013;32(1):3.

7Boltjes A,van Wijk F.Human dendritic cell functional specialization in steady-state and inflammation〔J〕.Frontiers Immunol,2014;5:131.

8Solinas G,Germano G,Mantovani A,etal.Tumor-associated macrophages(TAM) as major players of the cancer-related inflammation〔J〕.J Leukoc Biol,2009;86(5):1065-73.

9Ruffell B,Coussens LM.Macrophages and therapeutic resistance in cancer〔J〕.Cancer Cell,2015;27(4):462-72.