他莫西芬对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用及临床意义

杨建博 焦甲勋 赵 磊 武佳奇 闫广辉 靳宪辉 刘 斌 尚红涛

(哈励逊国际和平医院骨二科，河北 衡水 053000)

骨肉瘤具有较高的发病率，易发生侵袭转移，疾病进展较快〔1，2〕。近年来，临床上主要采取手术和新辅助化疗的方式治疗，其中化疗是治疗骨肉瘤的重要组成部分，但已发生转移的患者对化疗的敏感性差，易引起化疗毒性反应、心力衰竭等并发症，5年生存率仍然较低〔3〕。因此，探索新的治疗方法成为骨肉瘤研究领域的重点和热点之一。他莫西芬又叫三苯氧胺，是一种选择性雌激素受体调节剂，结合并部分激动雌激素受体α，也可完全拮抗雌激素受体β〔4〕。研究表明，他莫西芬能抑制乳腺癌细胞增殖，诱导其凋亡，从而阻碍乳腺癌的发生、发展〔5〕。近年来的研究发现他莫西芬可作为一种化疗增敏剂增强雌激素受体阳性肿瘤非性激素靶器官的化疗敏感性并对细胞的耐药性具有一定的逆转作用，从而提高化疗的满意度〔6，7〕。本研究通过分析他莫西芬对骨肉瘤细胞增殖、凋亡、侵袭的影响，探讨其作用机制和临床意义。

1 材料与方法

1.1实验材料与仪器 人骨肉瘤细胞系MG-63购自中国科学院上海细胞库，RPMI1640培养基、胰酶、胎牛血清、青霉素、链霉素购自美国Gibco公司，MTT试剂、他莫西芬购自美国Sigma公司，细胞凋亡检测试剂盒购自上海Solarbio公司，Matrigel基质胶、Transwell侵袭小室购自美国BD公司，基质金属蛋白酶(MMP)-2抗体、MMP-9抗体、β-肌动蛋白(actin)抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗，购自北京金桥生物公司。CO2细胞培养箱购自美国Thermo Scientific公司，流式细胞仪购自美国BD公司，超净工作台购自苏州净化设备公司，移液器购自德国Eppendorf公司，倒置显微镜购自日本Olympus公司。实验动物：SD大鼠，3～4周龄，体重(60±3)g，购自南京鹏晟生物公司。

1.2细胞的培养 细胞MG-63培养于RPMI1640培养基，加入10%胎牛血清和双抗，置于5% CO2、37℃培养箱中培养。待细胞融合度达到80%～90%，无菌吸管吸取培养基，加入3 ml 0.25%胰酶消化细胞，显微镜下观察细胞间距，加入含10%胎牛血清培养基终止反应，按1∶3的比例进行传代，置于培养箱中。

1.3MTT检测转染细胞的增殖情况 0.25%胰酶消化对数期细胞，将细胞密度调整为5×103个/ml，取100 μl细胞悬浮液加入 96孔培养板上，在37℃、5% CO2恒温培养箱中培养24 h，加入200 μl不同浓度的他莫西芬处理细胞，他莫西芬的浓度分别为1、2、4、8、16 μmol/L，未经处理的细胞作为对照组，每孔5个复孔，培养48 h后，每孔加入20 μl MTT溶液(5 μg/ml)，继续培养4 h，加入150 μl二甲基亚砜 (DMSO)，振荡混匀10 min，检测570 nm波长处的吸光度值(OD值)，实验重复3次。

1.4流式细胞术检测细胞的凋亡情况 收集16 μmol/L他莫西芬处理的细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次，调整细胞密度为5×104个细胞接种于培养瓶中，采用200 μl Annexin V-FITC缓冲液重悬细胞，加入5 μl Annexin V-FITC，混匀后置避光处反应15 min，加入10 μl PI，避光反应5 min，置于流式细胞仪中检测细胞的凋亡率。

1.5Transwell法检测细胞的侵袭能力 加入无血清的RPMI1640培养基将Matrigel胶稀释为20 g/ml，取50 μl稀释好的Matrigel胶均匀铺在Transwell小室膜中，37℃放置2 h，备用。将细胞使用不含血清的培养基培养12 h，胰酶消化，加入新鲜无血清培养基重悬细胞，取2.5×105个细胞加入上室中，下室中加入500 μl完全培养基，在37℃培养箱中培养24 h，采用无菌湿棉擦去基质胶和小室膜表面细胞，预冷的甲醛固定30 min，苏木素染色1 min，随机选取6个视野，在高倍显微镜下计数，取平均值，实验重复3遍。

1.6Western印迹检测MMP-9、MMP-2蛋白的表达 PBS漂洗2次，收集细胞，加入RIPA细胞裂解液，在冰上放置30 min，离心，所得上清即为细胞中总蛋白。BAC法检测蛋白质浓度，100℃煮沸10 min使蛋白质充分变性。提前配置5 ml 10%的SDS-PAGE分离胶和2 ml 5% SDS-PAGE浓缩胶，每孔加入15 μl样品蛋白，40 V恒压电泳至溴酚蓝进入分离胶，将电压调整为60 V电泳至溴酚蓝到达分离胶底部。切除多余凝胶，与硝酸纤维素膜、目的蛋白凝胶均置于转移缓冲液中平衡，200 mA电流作用90 min，TBST洗膜3次，每次10 min，将携带目的蛋白的硝酸纤维素膜放入封闭液中封闭1 h。加入一抗，4℃过夜，TBST洗涤3次，每次10 min，加入二抗，室温孵育振荡60 min，TBST洗涤3次，每次10 min，加入化学发光剂，暗室中曝光、显影、定影，冲洗晾干，以β-actin为参照，Quantity One分析蛋白质的灰度值。

1.7动物造模及药物干预 PBS漂洗对数期细胞，使用不含血清的培养基将细胞密度调整为1×107/ml，使用1 ml注射器于裸鼠左右后肢胫骨结节处穿刺至骨髓腔接种细胞悬浮液0.2 ml/只，接种后6～12 d，在接种部位出现肿瘤包块，而且随着时间逐渐增大大鼠出现明显跛行认为造模成功。将造模成功的裸鼠随机分为两组：模型组和给药组。根据小鼠体重计算给药剂量，模型组给予0.2 ml/只蒸馏水，给药组给予3.6 mg/kg他莫西芬，连续给药21 d，测量肿瘤体积变化。

1.8统计学方法 采用SPSS22.0软件，两组比较采用两样本独立t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间差异使用LSD-t检验。

2 结 果

2.1他莫西芬对骨肉瘤细胞增殖的影响 与对照组(0.689±0.052)相比，浓度分别为1、2、4、8、16 μmol/L他莫西芬组细胞的吸光值(0.564±0.043，0.462±0.041，0.398±0.022，0.291±0.027，0.158±0.023)显著降低(F=81.395，P=0.000；t1=4.199，t2=7.625，t3=9.775，t4=13.369，t5=17.837，均P<0.05)，表明在一定浓度范围内，细胞的增殖与药物的浓度具有显著的剂量依赖性。

2.2他莫西芬对骨肉瘤细胞凋亡的影响 与对照组〔(3.569±0.286)%〕相比，骨肉瘤细胞经他莫西芬作用后凋亡率〔(23.623±3.588)%〕显著增加(t=9.650，P<0.05)，表明他莫西芬可促进骨肉瘤细胞的凋亡。

2.3他莫西芬对骨肉瘤细胞侵袭以及侵袭相关蛋白的影响 与对照组相比，骨肉瘤细胞经他莫西芬作用后侵袭细胞数目显著降低(t=13.267，P<0.05)；他莫西芬干预骨肉瘤细胞后可降低细胞中MMP-9、MMP-2蛋白表达量(t1=5.324，t2=5.782，P<0.05)。见图1，表1。

图1 他莫西芬对骨肉瘤细胞中MMP-9、MMP-2蛋白表达量的影响

组别侵袭细胞(个)MMP-9蛋白MMP-2蛋白对照组65.258±4.6741.233±0.1961.452±0.217他莫西芬组20.415±3.5251)0.589±0.0741)0.674±0.0851)

与对照组相比：1)P<0.05

2.4他莫西芬对裸鼠肿瘤体积的影响 与模型组〔(8.326±1.269)cm3〕相比，造模成功后给予他莫西芬可显著抑制肿瘤体积的增大〔(3.452±0.895)cm3,t=5.436，P<0.05〕，表明他莫西芬可抑制骨肉瘤肿瘤的生长。

3 讨 论

虽然骨肉瘤的治疗手段不断进步，提高了原发骨肉瘤患者的5年生存率，但由于骨肉瘤具有较高的侵袭、迁移能力，易发生远端转移如肺转移〔8〕。骨肉瘤伴肺转移患者的5年生存率显著降低，成为导致骨肉瘤患者死亡的最重要的原因〔9〕。因此，干预骨肉瘤细胞增殖、侵袭等特性成为研究骨肉瘤预防和治疗的热点之一。由于副作用较小，他莫西芬常作为一种非甾体类选择性雌激素受体治疗恶性肿瘤〔10〕。他莫西芬可与雌激素受体结合，对不同的肿瘤组织表现不同的作用。雌激素的靶器官主要有乳腺和子宫，因此近年来他莫西芬常用来治疗乳腺癌和子宫癌并取得了较好的疗效〔11〕。在雌激素受体阳性的乳腺癌组织中，他莫西芬主要通过拮抗雌激素受体，阻碍其信号传导，从而阻断细胞的分裂，抑制乳腺癌细胞的增殖〔12〕。研究发现他莫西芬不仅对雌激素受体阳性的癌症有重要作用，还可抑制雌激素受体阴性的恶性肿瘤的发生、发展，如胰腺癌、黑色素瘤等〔13，14〕。本研究发现不同浓度他莫西芬干预骨肉瘤细胞，其细胞的增殖受到抑制，且具有一定的浓度依赖性；骨肉瘤细胞经他莫西芬处理后凋亡率增加，侵袭能力降低；他莫西芬可抑制肿瘤体积的增加，提示他莫西芬可抑制骨肉瘤的发生、发展。

MMPs是一类降解细胞基底膜和细胞外基质的生物酶。MMP-2和MMP-9是MMPs家族中的重要成员，参与多种肿瘤的侵袭、迁移过程〔15，16〕。在骨肉瘤中，MMP-2和MMP-9的表达量增加，提示MMP-2和MMP-9可能参与骨肉瘤细胞的侵袭、迁移过程〔17〕。同时，MMP-2和MMP-9不仅降解细胞基底膜和细胞外基质，还可促进毛细血管的生长，从而促进骨肉瘤细胞的侵袭和转移〔18〕。本实验中Western印迹的结果也提示他莫西芬可能通过降低侵袭相关蛋白的表达抑制骨肉瘤细胞的侵袭能力。

综上所述，他莫西芬可抑制骨肉瘤细胞的增殖，促进其凋亡，可能通过降低MMP-9、MMP-2蛋白的表达抑制其侵袭能力，对骨肉瘤的治疗和预后有重要意义。

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