生血宁片对肿瘤坏死因子α诱导的白细胞活化的影响及相关机制

朱 彤 饶井芬 李青山

(承德医学院附属医院肿瘤科，河北 承德 067000)

炎症反应是冠状动脉粥样硬化、感染性休克等多种疾病的病理基础，白细胞与内皮细胞的黏附、跨内皮移行是炎症反应的主要环节〔1，2〕。生血宁片的主要成分为蚕砂提取物，具有益气补血的功效，对贫血症状有较好疗效。最新研究发现，生血宁片可有效减轻不良炎症反应，降低炎症相关疾病的复发率〔3〕，但其作用机制仍未明确。为此，本次研究通过观察生血宁片对炎性介质肿瘤坏死因子(TNF-α)诱导的人外周血中性白细胞与内皮细胞黏附和游出的影响并分析其相关机制，为炎症相关疾病治疗提供新的可能。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器 生血宁片(武汉联合药业有限公司，国药准字Z20030088)，TNF-α、1640细胞培养液(上海元龙生物技术有限公司)，CD11b、CD18抗体(上海广锐生物科技有限公司)，人髓过氧化物酶ELISA试剂盒(北京方程生物科技有限公司)；流式细胞仪(美国BD公司)，酶标仪(瑞士TECAN公司)。

1.2方法

1.2.1外周血中性白细胞分离 采集志愿者血液，抗凝处理后与等体积Hanks液混合均匀，加淋巴细胞分离液，室温下3 000 r/min离心30min，取上层与中层分界面之间的白色窄型条带为中性白细胞层，吸出后用3倍体积的1640细胞培养液混合均匀，3 000 r/min离心15 min，用细胞培养液冲洗细胞3次，离心后用含10%胎牛血清的1640细胞培养液重悬细胞，Trypan blue法检测活细胞比例高于90%时进行后续实验。

1.2.2细胞黏附实验 将对数期白细胞以1×104/孔密度接种到96孔板中，细胞培养板中用含10 μg/ml纤维蛋白原和10%胎牛血清的内皮细胞基础培养基平铺，给药组分别加入终浓度为1、10、100 μmol/L的生血宁片，37℃ CO2孵箱中培养60 min，之后滴加20 ng/ml的TNF-α，37℃静置60 min，取上清后按ELISA试剂盒说明书依次加入反应液，读取450 nm处的吸光度值。

1.2.3跨膜迁移实验 采用Transwell小室法，将肺动脉内皮细胞加入3 μm孔径的流动小室，用含10%胎牛血清的内皮细胞培养液培养48 h。按2×106/孔密度在流动小室表面平铺中性白细胞，给药组分别加入终浓度为1、10、100 μmol/L的生血宁片，37℃ CO2孵箱中培养60 min后再加入20 ng/ml的TNF-α，同时向流动小室底部加0.1 μmol/L的fMLP。37℃反应4 h，光学显微镜下行中性白细胞计数并拍照。

1.2.4表面黏附分子表达情况检测 采用流式细胞术进行检测，向中性白细胞悬液中滴加20 ng/ml的TNF-α，37℃反应60 min。给药组分别加入终浓度为1、10、100 μmol/L的生血宁片，37℃ CO2孵箱中培养60 min，沉降细胞后用磷酸缓冲液冲洗，重悬细胞并滴加荧光标记的鼠抗人CD11b抗体、鼠抗人CD18抗体、阴性对照抗体，室温下静置30 min，上流式细胞仪检测荧光强度。

1.3统计学分析 用SPSS21.0软件进行F检验。

2 结 果

2.1生血宁片对TNF-α诱导的白细胞黏附的影响 空白对照组、TNF-α组吸光度值分别为(0.026±0.003)、(0.148±0.024)；1、10、100 μmol/L的生血宁片组的吸光度值分别为(0.129±0.034)、(0.093±0.010)、(0.062±0.017)。TNF-α组明显提升了中性白细胞活性，黏附能力明显强于空白对照组(P<0.01)；生血宁片对中性白细胞黏附能力的抑制呈剂量依赖性，10、100 μmol/L的生血宁片组黏附能力均明显低于TNF-α组(P<0.05)。

2.2生血宁片对TNF-α诱导的白细胞跨膜迁移的影响 空白对照组、TNF-α组中性白细胞游出数分别为0.51、1.73×106个；1、10、100 μmol/L的生血宁片组分别为1.61、1.45、1.03×106个。TNF-α组中性白细胞跨膜迁移力明显强于空白对照组(P<0.01)；生血宁片对中性白细胞跨膜迁移的影响也呈剂量依赖性，10、100 μmol/L组的白细胞游出数均明显低于TNF-α组(P<0.05)。见图1。

图1 Transwell小室检测结果(×400)

2.3生血宁片对TNF-α诱导的中性白细胞黏附分子表达的影响 空白对照组、TNF-α组CD11b的表达量分别为(47.25±5.91)、(187.39±12.93)；1、10、100 μmol/L的生血宁片组分别为：(206.86±16.94)、(143.31±9.67)、(91.62±18.35)。CD18的表达量分别为(97.34±4.05)、(442.91±8.04)；生血宁片组分别为：(428.42±10.30)、(360.91±8.01)、(248.39±12.36)。TNF-α组CD11b和CD18的表达量均明显高于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.01)；生血宁片对CD11b和CD18的表达量抑制作用呈剂量依赖性，10、100 μmol/L组的CD11b和CD18的表达量均明显低于TNF-α组(P<0.05)。

3 讨 论

炎症反应的始发环节包括白细胞与内皮黏附、沿血管壁迁移并渗出到血管外〔4〕，其中白细胞渗出到血管外后可分泌过氧化物和炎性介质参与多种疾病发展并可引发组织损伤、多器官功能障碍。目前，临床治疗炎症相关疾病的主要思路是对中性白细胞渗出和黏附过程进行有效的干预抑制〔5〕。本次研究显示，生血宁片可呈剂量依赖性抑制TNF-α诱导的中性白细胞黏附能力和跨膜迁移能力。

白细胞黏附分子CD11b、CD18在介导白细胞和血管内皮黏附、游出过程中发挥重要作用〔6〕。CD11b、CD18属于β2整合素家族，能够与C3bi、CD54等炎症相关配体结合，诱发白细胞及内皮的黏附，促进炎性细胞趋化性转移、汇聚、吞噬等过程〔7〕。CD11b和CD18在正常生理状态下也表达于白细胞表面，但受TNF-α等炎症相关因子诱导后，中性白细胞细胞表面的CD11b和CD18的表达量明显增加〔8〕。本次研究通过流式细胞术检测发现，中性白细胞经TNF-α刺激诱导后炎性黏附分子CD11b和CD18的荧光表达强度明显增加，说明生血宁片通过抑制白细胞表面黏附分子的表达，进而实现对炎性介质诱发的白细胞黏附、游出过程进行抑制，但其中生血宁片对白细胞黏附分子活化的相关机制仍需进一步研究证实。

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3李淑波，鞠文博，王春梅，等.D-半乳糖肝脏损伤动物模型的建立及其检测〔J〕.北华大学学报(自然科学版)，2015;16(5)：601-4.

4Lingappa B，Sujith KV，Adhikari A,etal.One-pot synthesis of pyramid inothiazolidinones and their anti-inflammatory and antimicrobial studies〔J〕.Phosphorus Sulfur Silicon Rel Elements，2010;185(3/4)：501-8.

5张 越.乳腺浸润性导管癌的超声征象与血清肿瘤标志物的相关性分析〔J〕.中国卫生工程学，2016;15(3)：279-80.

6徐 婷.肾移植术受者PMNs中CD11b/CD18和MPO的表达的变化〔D〕.郑州：郑州大学，2011.

7江 波.重组水蛭素对大鼠皮肤撕脱伤中CD11b、CD18及ICAM-1动态表达影响的研究〔D〕.泸州：泸州医学院，2012.

8Kuo PC，Li YC，Hwang TL,etal.Synthesis and structural characterization of an anti-inflammatory principle purified from Lindera aggregata〔J〕.Tetrahedron Lett，2014;55(1)：108-10.