丁苯酞对血管性痴呆大鼠海马CA1区Bax和Bcl-2表达的影响

姚 刚 朱博驰 于挺敏 满玉红

(吉林大学第二医院神经内科，吉林 长春 130041)

丁苯酞(NBP)是人工合成的消旋正丁基苯酞，是治疗缺血性脑卒中的国家级一类新药，能够明显减轻急性缺血性脑卒中患者中枢神经功能缺损〔1〕。目前发现NBP对血管性痴呆(VD)也有较明显的改善作用〔2，3〕，但其作用机制还缺乏深入的研究。脑血管病后慢性脑缺血是VD最常见的病因，其病理机制与脑缺血引发的认知功能相关脑区神经细胞凋亡、氧化应激、能量代谢障碍、兴奋性氨基酸、炎性因子、胆碱能通道功能受损等多种因素有关，其中细胞凋亡学说是人们研究的热点〔4，5〕。B淋巴细胞淋巴瘤(Bcl)-2家族，通过线粒体相关信号通路调节细胞凋亡〔6〕，其中以Bax基因为代表的促凋亡基因与以Bcl-2基因为代表的抗凋亡基因相互拮抗，实现对细胞凋亡的调控。本研究通过观察NBP对VD大鼠海马CA1区Bax和Bcl-2表达的影响，探讨NBP对VD大鼠的保护作用及机制。

1 材料和方法

1.1实验动物、主要试剂和仪器 80只健康SPF级Wistar大鼠(雌雄各半)，体重200～220 g，购于吉林大学基础医学院动物中心，动物合格证号：SCXK(吉)2003-001。丁苯酞氯化钠注射液(石药集团恩必普药业有限公司，批准文号：国药准字H20100041)。大鼠抗Bcl-2多克隆抗体、抗Bax多克隆抗体购自北京博奥森生物公司。

1.2分组 大鼠饲养于吉林大学第二医院动物实验室，室内温度22℃～26℃，相对湿度40%～60%，光暗周期12 h，自由摄取食物和水，动物模型制备前适应性喂养7 d。按随机分组法分为VD组、NBP治疗组、NBP对照组、Sham组，每组20只，每组又分为4个亚组：术后1、2、4、8 w，每个亚组5只。

1.3动物模型制备 采用永久性双侧颈总动脉结扎法制备VD大鼠模型。VD组和NBP治疗组大鼠术前禁食、禁水8 h，10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，仰卧位固定于操作台，常规消毒颈部手术区域，颈前正中作一长约1 cm的纵形切口，钝性逐层分离皮下软组织、颈前肌群，分离出气管侧后方的颈动脉鞘，进而分离颈总动脉与迷走神经，以1号丝线永久结扎颈总动脉，同法结扎另一侧颈总动脉。局部消毒后恢复组织层次并缝合皮肤。Sham组和NBP对照组大鼠除不结扎双侧颈总动脉外，其余操作与VD组和NBP治疗组大鼠一致。术后动物另放于干净鼠笼饲养，自由获取水源及饲料。

1.4药物干预 NBP对照组和NBP治疗组大鼠清醒后(术后1 d，可在笼中自由活动)，给予丁苯酞氯化钠注射液腹腔注射，剂量为5 mg·kg-1·d-1(药物剂量根据成人常规每日剂量进行换算)，Sham组和VD组大鼠给予生理盐水腹腔注射(0.2 ml/d)。各组大鼠连续腹腔注射给药7 d。

1.5标本采集及免疫组化 各组大鼠在术后各时间点(1、2、4、8 w)，给予10%水合氯醛腹腔注射麻醉(麻醉剂量0.3 ml/100 g)，生理盐水心脏灌注5 min，断头取脑，分离出海马，将组织块迅速置入10%中性甲醛固定48 h，PBS洗脱3次，80%～100%梯度酒精脱水，二甲苯透明后，石蜡包埋，制成厚度为4 μm的切片。免疫组化方法采用SP法。

1.6显微图像采集及分析 每张切片于400倍镜下随机选取5个视野，利用Leica Qwin图像分析系统检测阳性表达灰度值，同时计算每个视野下的阳性细胞总数占所有细胞总数的比率，细胞表达平均灰度计算采用视野灰度×阳性细胞比率，以5个视野的平均值表示。

1.7统计学分析 采用SPSS17.0软件包组间差别采用单因素方差分析和Tukey比较。

2 结 果

2.1Bax蛋白在各组大鼠海马CA1区的表达 Bax蛋白阳性表达显示为黄棕色颗粒，主要定位于细胞质。VD组大鼠海马CA1区神经元数目较少，排列紊乱，部分细胞出现空泡样变性，Bax表达呈强阳性，主要位于神经元。NBP治疗组大鼠海马CA1区神经元损伤明显减小，Bax表达显著减弱。见图1，图2。

图1 1 w、2 w Bax蛋白在各组大鼠海马CA1区的表达(DAB，×400)

VD组和NBP治疗组大鼠1 w、2 w、4 w和8 w时海马CA1区Bax蛋白表达灰度明显高于Sham组(P<0.05)；NBP治疗组大鼠4 w和8 w时海马CA1区Bax蛋白表达均明显低于VD组大鼠相应时间点(P<0.05)。VD组大鼠不同时间点CA1 区Bax表达灰度比较，8 w组明显高于1 w和2 w组(P<0.05)。见表1。

2.2Bcl-2蛋白在各组大鼠海马CA1区的表达 Bcl-2蛋白阳性表达显示为黄棕色颗粒，主要定位于细胞质。VD组大鼠海马CA1区Bcl-2蛋白表达弱或无表达，NBP治疗组大鼠海马CA1区 Bcl-2表达显著增加，NBP对照组大鼠海马CA1区Bcl-2表达最强，NBP对照组和Sham组大鼠海马组织结构完好，神经细胞分布正常，Bcl-2表达中等程度或低表达。见图3，图4。

表1 各组大鼠海马CA1区Bax表达灰度比较

与Sham组比较：1)P<0.05；与VD组比较：2)P<0.05；与同组8 w比较；3)P<0.01；下表同

图3 1 w、2 w Bcl-2蛋白在各组大鼠海马CA1区的表达(DAB，×400)

图4 4 w、8 w Bcl-2蛋白在各组大鼠海马CA1区的表达(DAB，×400)

各时间点，NBP对照组大鼠海马CA1 区Bcl-2表达灰度均明显高于Sham组(P<0.05)；2 w、4 w和8 w时NBP对照组大鼠海马CA1 区Bcl-2表达灰度均明显高于VD组(P<0.05)；8 w时NBP治疗组大鼠海马CA1 区Bcl-2表达灰度明显高于VD组(P<0.05)。各组大鼠海马CA1 区Bcl-2表达灰度在不同时间点比较均无统计学差异(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠海马CA1区Bcl-2表达灰度比较

3 讨 论

永久性双侧颈总动脉结扎法制备VD大鼠模型是目前公认的VD造模方法，大鼠脑血管系统与人类一样，具有发达的脑动脉环(Willis环)，当双侧颈总动脉结扎后，并不会造成前脑组织的血供完全阻断，而是处于缺血状态〔7〕，接近VD慢性脑灌注不足的发病机制。海马、额叶等脑区的缺血性损伤是发生VD的基础。

研究发现，濒死状态的神经元中Bax呈高度表达〔8〕，Bax过度表达可以拮抗Bcl-2抑制凋亡作用，促进凋亡的发生。实验研究发现，前脑缺血可以导致海马CA1区诱导凋亡的Bax蛋白表达增加，Bax蛋白表达高峰先于DNA碎裂高峰，因而认为，Bax蛋白过度表达引起了海马CA1区神经元DNA断裂和凋亡〔9〕。本实验发现，NBP能够对前脑缺血导致的海马CA1区Bax蛋白过度表达起到抑制作用。

Bcl-2与Bax具有高度同源的氨基酸序列，其抗凋亡作用受到Bax的拮抗，Bcl-2/Bax的比值对神经细胞凋亡起着关键的作用〔10〕。Bcl-2在线粒体水平对抗各种凋亡刺激，对细胞起保护作用，其抗凋亡机制包括抑制Ca2+超载、抑制氧自由基、控制凋亡信号传导途径、抗谷氨酸毒性等多个方面〔11〕。Manji等〔12〕认为提高中枢神经系统Bcl-2的表达水平，能够提高神经元承受损伤的能力，还可以促进神经轴突的再生。本研究发现，NBP对照组大鼠海马CA1区Bcl-2表达最强，VD组大鼠海马CA1区Bcl-2蛋白表达有下降趋势，但未发现有统计学意义。8 w时，NBP治疗组大鼠海马CA1区Bcl-2表达显著增加，提示NBP可以提高大鼠海马CA1区Bcl-2蛋白的表达水平。本实验在制备VD大鼠的基础上，应用NBP给予干预治疗，观察不同时间点大鼠海马CA1区凋亡调控基因Bcl-2家族中促凋亡的Bax和抗凋亡的Bcl-2表达情况。结果发现：VD大鼠海马CA1区促凋亡蛋白Bax过度表达，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达有减弱趋势；NBP对VD大鼠海马CA1区细胞凋亡具有明显的保护作用，可以抑制缺血损伤导致的海马CA1区Bax蛋白过度表达，同时能够提高大鼠海马CA1区Bcl-2蛋白的表达水平，抑制细胞凋亡，促进细胞存活，发挥神经保护作用。

1朱以诚，崔丽英，高 山，等.丁苯酞注射剂治疗急性脑梗死的多中心、随机、双盲双模拟、对照Ⅲ期临床试验〔J〕.中华神经科杂志，2014；(2)：113-8.

2程文姚，杨 健，余新沛.丁苯酞软胶囊与尼莫地平对卒中后血管性痴呆患者的疗效〔J〕.解放军预防医学杂志，2016；34(4)：516-8.

3赵万红，罗 超，龚应霞，等.消旋丁苯酞对慢性脑缺血大鼠认知功能的影响及其生化机制研究〔J〕.中华老年医学杂志，2014；33(4)：412-5.

4Sun ZK，Ma XR，Jia YJ，etal.Effects of resveratrol on apoptosis in a rat model of vascular dementia〔J〕.Exp Ther Med，2014；7(4)：843-8.

5Yang S，Zhou GG，Liu H，etal.Protective effects of p38 MAPK inhibitor SB202190 against hippocampal apoptosis and spatial learning and memory deficits in a rat model of vascular dementia〔J〕.Biomed Res Int，2013；2013：215798.

6Lock RB，Murphy KM.Immunodetecing members of the Bcl-2 family of proteins 〔J〕.Methods Mol Med，2005；111(1)：83-96.

7Li Y，Zhang ZX.Gastrodin improves cognitive dysfunction and decreases oxidative stress in vascular dementia rats induced by chronic ischemia〔J〕.Int J Clin Exp Pathol，2015；8(11)：14099-109.

8Prakasa Babu P，Yoshida Y，Su M，etal.Immunohistochemical expression of Bcl-2，Bax and cytochrome C following focal cerebral ischemia and effect of hypothermia in rat〔J〕.Neurosci Lett，2000；291(3)：196-200.

9Kaneda K，Kashii S，Kurosawa T，etal.Apoptotic DNA fragmentation and upregulation of Bax induced by transient ischemia of the retina〔J〕.Brain Res，1999；815(1)：11-20.

10Lindqvist LM，Vaux DL.BCL2 and related prosurvival proteins require BAK1 and BAX to affect autophagy〔J〕.Autophagy，2014；10(8)：1474-5.

11Wang QQ，Zhang LL，Yuan XD，etal.The relationship between the Bcl-2/Bax proteins and the mitochondria-mediated apoptosis pathway in the differentiation of adipose-derived stromal cells into neurons〔J〕.PLoS One，2016；11(10)：e0163327.

12Manji HK，Moore GJ，Chen G.Lithium upregulates the cytoprotective Bcl-2 in the CNS in vivo：a role for neurotrophic and neuroprotective effects in manic depressive illness〔J〕.J Clin Psychiatry，2000；61(9)：82-96.