2型糖尿病ZDF大鼠模型的最佳成模时间及解毒通络调肝方的干预作用

金美英 朴春丽 赵宗江 米 佳 刘向荣 陈 曦

(长春中医药大学附属医院，吉林 长春 133021)

理想的糖尿病动物模型是研究糖尿病的有力工具，在2型糖尿病(T2DM)的科研中起着重要的作用。国内相关ZDF大鼠模型制备研究较少，并且国际上不同的实验室诱导的时间和条件不同，成模的情况也不一致。本课题通过Purina #5008饲养9周龄雄性ZDF大鼠，诱导人类T2DM机制，制备自发性T2DM动物模型，动态分析ZDF大鼠体重与血糖的变化,对ZDF大鼠T2DM模型的稳定性及持续性进行分析，试图摸索出最佳成模时间。T2DM的两个发病关键环节是胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能减退。中医药对于T2DM的发生和控制T2DM的进展有独特的见解，解毒通络调肝方是根据中医“毒损络脉”病机，从“肝”论治糖尿病理论结合临床实践确立的治疗T2DM的大法，在T2DM的临床应用中显示出良好的疗效〔1～3〕。因此，本实验拟观察解毒通络调肝方对ZDF T2DM动物模型的影响，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1动物与饲料 SPF级健康、雄性9周龄Zucker Diabetes Fat(ZDF)大鼠88只，SPF级健康、雄性9周龄Zucker Lean(ZL)大鼠10只(北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SCXK京 2014-0003)。高脂饲料Purina #5008〔购于北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号 SCXK(京) 2009-0008〕，实验大鼠置于洁净动物橱(北京文慧净化设备厂制造，专利号：EJ932041477)中饲养，饲养环境为室温(23～25)℃，相对湿度50%～60%，每日12 h光照维持，所有大鼠自由饮水。

1.2实验药物 治疗药为解毒通络调肝方(由榛花15 g、大黄30 g、黄连15 g、双花15 g、黄芪30 g、丹参15 g、柴胡10 g组成，长春中医药大学附属医院制剂室提供，4℃冰箱保存)；对照药为盐酸二甲双胍片(天津太平洋制药有限公司，批号 080313)。

1.3动物模型的建立 88只9周龄雄性ZDF大鼠以Purina #5008饲养，10只9周龄雄性ZL大鼠以维持饲料#1022饲养。动态观察随机血糖及体质量的变化，以随机血糖≥11.1 mmol/L作为T2DM成模标准〔4〕，第5周及第8周各随机抽取10只、15只ZDF大鼠测量随机血糖水平。饲养第10周对88只ZDF大鼠进行随机血糖监测，根据血糖水平分为<11.1 mmol/L、11.1～16.9 mmol/L、>16.9 mmol/L三种血糖梯度，然后将大鼠重新分笼饲养，第11周对血糖浓度<11.1 mmol/L的大鼠再次进行随机血糖监测，选出符合成模标准的大鼠，并将第10周及第11周已符合成模标准的大鼠重新随机分组饲养，至第12周将已成模大鼠及未成模大鼠再次进行随机血糖监测，判断其模型的稳定性。

1.4实验分组 造模前将ZL大鼠(10只)设为对照组； ZDF大鼠(88只)设为造模组，饲养诱导制备T2DM动物模型。第13周将ZL大鼠与已成模的ZDF大鼠进行分组，ZL(10只)大鼠作为正常组；成模ZDF大鼠按血糖水平随机分为5组，模型组(15只)，盐酸二甲双胍(西药)组(11只)，解毒通络调肝方大小剂量组，每组各11只。

1.5给药 饲养第13周开始进行药物灌胃，模型组与正常组以等体积蒸馏水灌胃，1次/d，西药组：临用前将二甲双胍搅拌至完全溶解，用蒸馏水稀释，给药剂量为0.5 g/kg，1次/d。解毒通络调肝方小、中、大剂量组：蒸馏水稀释，灌胃剂量为1、3、5 g/kg，按所含原药材量计算，1次/d。灌胃时间均为每日上午9：00，治疗周期为4 w。观察大鼠一般状态，每周称量记录体质量。

1.6观察指标 开始饲养后每周进行一次称重观察体质量变化情况，饲养期间结合一般状态在第5、8、10、11、12、17周均进行随机血糖的监测。药物灌胃结束后第17周禁食12 h，各组大鼠采用腹腔注射10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)麻醉。经股动脉取血，加入10 ml干净离心管，静置2 h后，2 500 r/min低温高速离心20 min，抽取上层血清，检测血糖(GLU)、糖化血红蛋白(HbA1c)、糖化血清蛋白(GSP)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的变化。

1.7统计分析 采用 SPSS20.0 软件行方差分析。

2 结 果

2.1动物模型制备 ZL大鼠精神状态好，动作灵敏好动，毛发有光泽。ZDF大鼠刚进入动物房的前几周活动灵活，随着周龄增加体质量逐渐增大〔造模第0、11、17周体质量分别为(262.78±3.70)、(447.00±4.06)、(458.93±8.96)g，第11、17周体质量与第0周比较差异显著(P<0.05)〕，形体变胖，毛色逐渐枯黄无光泽，渐渐开始懒惰，逐渐萎靡不振，逐步出现三多症状。在血糖方面，第5周〔(10.37±4.35)mmol/L〕与第8周〔(12.14±4.90)mmol/L〕比较有逐渐升高趋势，但无显著性差异(P>0.05)；饲养第10周出现并发症倾向，测随机血糖〔(15.30±7.12)mmol/L〕与第8周比较均有显著性升高(P<0.05)，符合成模标准54只，血糖<11.1 mmol/L的34只；第11周对未成模的34只ZDF大鼠复查血糖，符合成模标准20只，血糖<11.1 mmol/L的14只；经第10周与第11周两次筛查符合成模标准的大鼠73只(82.95%，共74只，死亡1只)，第11周(已成模)血糖均值为(18.18±5.47)mmol/L，继续饲养第12周复查血糖有小幅度升高，但与第11周(已成模)比较无显著差异(P>0.05)。第12周(未成模)〔(9.52±1.16)mmol/L〕与第11周(未成模)〔(9.02±0.99)mmol/L〕比较也无显著差异(P>0.05)。第17周(模型组)随机血糖〔(24.27±6.38)mmol/L〕进行性升高，与第12周(已成模)〔(18.76±5.27)mmol/L〕比较，有显著性升高(P<0.01)。9周龄雄性ZDF大鼠以Purina #5008饲养诱导11 w，符合2型糖尿病成模标准的大鼠达到82.95%，继续以Purina #5008饲养，经12 w、17 w反复复查随机血糖，证明其稳定性及持续性，得出9周龄雄性ZDF大鼠以Purina #5008饲养11 w诱导T2DM动物模型成模率较高，持续性及稳定性较好。ZDF大鼠饲养成模后，11 w与12 w已成模大鼠死亡2只，14 w模型组死亡1只，共死亡3只，ZDF大鼠死亡率为3.4%。ZL对照组大鼠无死亡。

2.2解毒通络调肝方对各组大鼠体质量的影响 与正常组比较，模型组、西药组、解毒通络调肝方大、中、小剂量组体质量有显著差异(P<0.01)；与模型组比较，西药组、解毒通络调肝方大、中、小剂量组体质量有下降趋势，但无明显统计学差异(P>0.05)。见表1。

表1 解毒通络调肝方对各组大鼠体质量的影响

与正常组比较:1)P<0.01

2.3解毒通络调肝方对各组大鼠糖代谢的影响 与正常组比较，模型组、西药组、解毒通络调肝方大、中、小剂量组GLU、HbA1c、胰岛素(INS)显著升高(P<0.01)；西药组与解毒通络调肝方大剂量组GLU明显低于模型组(P<0.05)，西药组与大剂量组无统计学差异；西药组、中剂量组GSP低于模型组(P<0.05)。见表2。

2.4解毒通络调肝方对两组大鼠脂代谢的影响 与正常组比较，模型组、西药组、解毒通络调肝方大、中、小剂量组TC、TG、HDL-C均显著升高(P<0.01)；与模型组比较，西药组、解毒通络调肝方大、中、小剂量组TC、HDL-C下降明显(P<0.01，P<0.05)，大剂量组、西药组与模型组比较TG下降明显(P<0.05)；与西药组比较，解毒通络调肝方大剂量组TC、TG、HDL-C下降明显(P<0.01，P<0.05)。见表2。

表2 解毒通络调肝方对糖、脂代谢的影响

与正常组比较:1)P<0.01；与模型组比较:2)P<0.05，3)P<0.01；与西药组比较：4)P<0.05,5)P<0.01

3 讨 论

糖尿病是一种由多源性病因引起的疾病，受社会因素、遗传因素、生活方式因素及环境因素等影响。

糖尿病中医称之为消渴病，以“毒邪”理论与“络病”理论为契机，“毒损络脉”为病机切入点，结合“肝脏”在消渴病发病中的作用，提出从“肝”论治糖尿病〔3～5〕，以解毒通络调肝法为治疗大法，方中选榛花、大黄为君药，重在解毒，活血化瘀，通经活络，祛浊化湿；黄连、双花清热解毒，燥湿祛浊；黄芪、丹参益气通络，疏通经络，扶正祛邪，共同增强君药解毒作用均为臣药；柴胡引药入肝经，疏利气机，为佐使药。全方攻补兼施、扶正祛邪，激活机体的排毒能力，通络以通畅络脉、推陈出新，调肝以调畅气机，求其平衡，乃正本求源之大法。解毒通络调肝方在T2DM的临床应用中显示出良好的疗效〔3～5〕。

目前，ZDF大鼠被公认为是先天遗传性T2DM和肥胖病模型动物，雄性ZDF大鼠必须经过Purina #5008特殊饲料诱导，才能出现高INS血症和高血糖症〔6〕，有报道称，Purina#5008饲料饲养条件下，雄性ZDF大鼠一般情况下6 w显现高INS血症；7 w开始显现高血糖，10 w发展为糖尿病(DM)，随着DM的发展，12 w逐步出现INS分泌障碍〔7〕。雌性ZDF大鼠在Purina#5008饲喂下不发展为DM〔8,9〕。ZL大鼠是非肥胖且非DM的模型动物，外表与ZDF大鼠相似，经常被用来作为ZDF大鼠的对照组模型动物。

本实验中发现 ZDF大鼠以Purina #5008饲养后第1～3周体质量增长迅速，饲喂第3周之后体质量增长放缓，随着周龄的增加，ZDF大鼠与ZL大鼠体重相差明显。ZDF大鼠Purina #5008饲养后由糖耐量异常逐步发展为高血糖状态，第11周成模率较高，已成模大鼠在第12、17周持续存在高血糖状态，同时随机血糖有进一步升高趋势，可排除应激性血糖升高可能性，从而证明ZDF大鼠T2DM动物模型的稳定性及持续性。同时发现ZDF大鼠T2DM动物模型除了高血糖还具有高INS血症、高TC血症及高TG血症等特征，符合人类T2DM相关特征，造模后模型的稳定性及持续性较好，同时死亡率较低，安全性较好，是理想的T2DM动物模型。解毒通络调肝方干预后，可降低血糖、调节血脂，从而控制T2DM发生、发展，为深入研究解毒通络调肝方治疗T2DM疗效机制提供了实验依据，为中医“毒损络脉”理论研究及从“肝”论治T2DM的临床应用提供了有力的实验依据。

1朴春丽,杨叔禹,仝小林,等.解毒通络调肝方对实验性糖尿病大鼠肝脏IRS表达的影响〔J〕.中华实用中西医杂志，2009;22(14):1176-9.

2于 淼,朴春丽,南 征.解毒通络调肝方对胰岛素抵抗大鼠肝脏NF-κB及MCP-1表达的影响〔J〕.中国老年学杂志,2010;30(8):2306-7.

3于 淼,朴春丽,南 征.2型糖尿病胰岛素抵抗从毒损肝络论治的理论初探〔J〕.上海中医药杂志,2007;41(3):18-20.

4Matteucci E，Giampietro O.Proposal open for discussion:defining agreed diagnostic procedures in experimental diabetes research〔J〕.J Ethnopharmacol，2008;115(2):163-72.

5潘长玉.糖尿病学〔M〕.北京：人民卫生出版社，2007：5-6.

6William TC.Animal modeles of type 2 diabetes clinical presentation and pathophysiological relevance to human condition〔J〕.ILMU，2006;47(3):186-7.

7Pick A，Clark J，Kubstrup C，etal.Role of apoptosis in failure of beta-cell mass compensation for insulin resistance and beta-cell defects in the male Zucker diabetic fatty rat〔J〕.Diabetes，1998;47(3)：358-64.

8Huang TH,Peng G,Kota BP,etal.Anti-diabetic action of Punica granatum flower extract:activation of PPAR-g and identification of an active compound〔J〕.Toxicol Appl Pharmacol,2005;207(2):160-9.

9Coimbra TM,Janssen U,Grone HJ,etal.Early events leading to renal injury in obese Zucker(fatty) rats with typeⅡ diabetes〔J〕.Kidney Int,2000;57(1):167-82.