丝胶对糖尿病大鼠海马生长激素及其受体表达的调节作用

李东哲 王丹丹 史 硕 宋妤轩 宋成军 陈志宏

(承德医学院人体解剖学教研室，河北 承德 067000)

糖尿病性昏迷、脑血管意外等糖尿病中枢神经系统并发症已经得到了医务工作者的广泛关注，但由糖尿病引发的认知功能障碍，即糖尿病脑病，因其进展缓慢，症状、表现缺乏特异性而受到了忽视〔1〕。海马作为边缘系统的主要组成部分，具有学习、记忆和空间定位的作用，与认知功能密切相关〔2〕。在此之前，本研究团队初步探讨了蚕茧水提物——丝胶的抗糖尿病作用，发现丝胶不仅可以明显降低2型糖尿病(T2DM)模型大鼠的血糖，还能够抑制造模大鼠血糖升高〔3〕，同时还发现丝胶能改善糖尿病肾脏功能和生精功能的损伤〔4,5〕。本研究拟分析丝胶灌胃后T2DM模型大鼠海马生长激素(GH)和生长激素受体(GHR)表达的变化，以期为糖尿病认知功能障碍的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1大鼠分组及处置 将10～12周龄的雄性清洁级SD大鼠(购自河北医科大学实验动物中心，许可证号712024)，随机分组，每组12只：①空白对照组，大鼠不给予任何处置，可以自由进食；②T2DM模型组，制备T2DM大鼠模型，造模后大鼠常规饲养，不予任何处理；③丝胶组，制备T2DM大鼠模型，造模后在常规饲养的同时用2.4 g/kg的丝胶1次/d灌胃治疗35 d。

丝胶的获取及使用方法：承德医学院蚕业研究所提供彩色蚕茧，将蚕茧用纯水浸泡后煎煮2次，过滤后合并2次的滤液，浓缩至所需浓度，4℃冰箱保存，灌胃前用37℃水浴箱复温。

1.2大鼠T2DM模型的建立 用pH 4.4的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，在临用时配制链脲佐菌素(streptozotocin，购自美国Sigma公司)溶液，浓度是2%，给予大鼠腹腔连续注射3 d(25 mg·kg-1·d-1)。1 w后以大鼠血糖(BG)≥16.7 mmol/L作为模型成功建立的标准。

1.3处死大鼠、取材、检测相关指标 配制4%的水合氯醛，以腹腔注射的方式麻醉大鼠，用毛细玻璃管从眼内静脉丛采集大鼠空腹静脉血。然后断头处死大鼠，在冰盘上迅速剥离脑组织并取双侧海马，液氮速冻后保存于-80℃冰箱。

1.3.1测定大鼠血液参数 血液标本3 000 r/min、离心20 min，取上层血清，BG采用葡萄糖氧化酶法，采用ELISA法检测GH水平(GH ELISA试剂盒，购自美国Rb公司)。

1.3.2检测大鼠海马GH和GHR的表达 (1)Weston印迹法检测GH和GHR蛋白的表达：提取海马组织中总蛋白；应用BCA蛋白试剂盒(购自北京泰格美科技有限公司)定量，蛋白上样量100 μg；15% SDS-PAGE凝胶电泳后转膜；5%脱脂奶粉封闭过夜；4℃摇床孵育一抗〔GH 1∶200(小鼠抗大鼠单克隆抗体，购自美国Santa Cruz公司)，β-actin 1∶1 000(小鼠抗大鼠单克隆抗体，购自美国Abcam公司)，GHR 1∶100(兔抗大鼠多克隆抗体，购自上海沪峰化工有限公司)〕过夜；室温下摇床孵育二抗〔山羊抗小鼠、兔IgG 1∶5 000(购自美国Sigma公司)〕2 h；应用电化学发光法(ECL)化学超敏发光液进行显影；应用EPSON扫描仪扫描胶片，应用Quantity One-v 4.6.2软件对目标条带的灰度值进行分析，以目标条带灰度值/内参条带灰度值作为GH和GHR蛋白的相对表达水平。(2)逆转录PCR法(RT-PCR)检测GH和GHR mRNA的表达：提取海马组织总RNA；鉴定RNA的完整性，逆转录为cDNA(逆转录反应条件：30℃加热10 min；55℃加热30 min；99℃加热5 min；5℃冷却5 min；终止反应)；对cDNA进行扩增(PCR引物序列及扩增条件见表1)；取扩增产物行2%琼脂糖凝胶电泳(90 V，40 min)；应用ZF型紫外透射反射分析仪进行摄像，应用Quantity One-v 4.6.2软件对目标条带进行分析，以目标条带光密度值/内参照条带光密度值作为GH和GHR mRNA的相对表达水平。

1.4统计学处理 使用SPSS20.0软件进行方差分析，组间的两两比较采用SNK法。

表1 PCR引物序列和扩增条件

2 结 果

2.1三组大鼠BG和血清GH水平比较 与空白对照组大鼠相比，T2DM模型组大鼠的BG和血清GH水平明显升高(P<0.05)；丝胶能明显降低T2DM模型大鼠的血糖和血清GH水平(P<0.05)。见表2。

2.2三组大鼠海马GH和GHR表达情况比较 与空白对照组大鼠相比，T2DM模型组大鼠海马GH蛋白和mRNA的表达水平明显升高，GHR蛋白和mRNA的表达水平明显降低(P<0.05)；与T2DM模型组大鼠相比，丝胶组大鼠海马GH蛋白、mRNA的表达水平明显降低，GHR蛋白、mRNA的表达水平明显升高(P<0.05)。见表3，图1，图2。

表2 各组大鼠的BG和血清GH水平

与T2DM模型组比较：1)P<0.05，下表同

表3 各组大鼠海马GH和GHR的表达比较

1.空白对照组，2.T2DM模型组，3.丝胶组；下图同图1 各组大鼠海马GH和GHR蛋白的表达

3 讨 论

GH是由腺垂体分泌的含有191个氨基酸的肽类激素，具有促进生长发育、调节新陈代谢及机体多种生理功能的作用，在哺乳动物GH还参与调节机体的免疫功能和神经系统的活动〔6〕。GH发挥作用的方式包括直接作用于靶细胞发挥作用；由胰岛素样生长因子(IGF)家族介导，通过GH/IGFs轴发挥作用；依赖JAK2激活的信号通路，其中JAK2-STAT5是GH诱导的改善代谢功能、促进机体生长的核心通路〔7〕；不依赖JAK2激活的信号机制，如GH可激活Src和ERK1/2，从而发挥相应的生理功能〔7〕。无论是哪一种方式，GH都需要首先与靶细胞膜表面的GHR结合，通过GHR介导，以不同的方式将信号传入细胞内，发挥GH的生理作用。有研究显示，GHR的含量、功能等均可影响GH生理功能的发挥〔8〕。在GH发挥作用的方式中，GH-GHR/IGF-1轴对中枢神经系统的作用逐步得到了学者们的关注。

目前，海马被认为是学习记忆的关键区域，而对于啮齿类动物来说，海马是空间学习的基本结构。有研究发现，不论1型糖尿病还是T2DM，均存在GH-GHR/IGF-1轴异常，且与糖尿病(DM)海马损伤导致的认知功能障碍密切相关〔9，10〕。DM时，高BG状态降低了下丘脑对葡萄糖的调节作用，从而减弱了葡萄糖对GH分泌的抑制作用，进而使GH水平升高〔11〕。DM伴随GH升高的情况下，不但更加难以控制BG，而且还会影响DM慢性并发症的发生发展；并且，过多的GH还能抑制GHR的表达，揭示了GH和GHR之间的自我调节机制，同时也提示了组织对GH的敏感性降低，因此导致了GH作用减弱〔12〕。而敲除或下调GHR的表达水平，可通过GH抵抗使IGFs介导的GH的多种作用减弱，在海马表现为神经元凋亡增加，认知功能下降〔13，14〕。

中医认为DM属于“消渴病”，病因比较复杂，先天禀赋不足是重要内因；长期饮食不节、积热，情志失调，劳欲过度、肾精亏损，终致肾虚肺燥而发消渴，治疗原则是清热生津、滋阴润燥、养阴益气。《本草纲目》记载，蚕茧“煮汤治消渴，古方无他”。中医认为蚕茧性味甘、温，和缓，温而不燥，补而不腻，以血肉友情之身，善补至虚至损之精气。现代药理研究证明蚕丝纤维中的丝胶有拟胆碱作用，并含铁、氟、锰、锌等微量元素，降糖解渴、治小便过多，民间亦有蚕茧泡水降BG的验方。本课题组前期观察了丝胶对T2DM模型大鼠肾脏损伤和生精功能障碍的保护作用〔5，6〕。本研究结果提示丝胶可能通过调节DM时海马GH和GHR的表达，进而通过改善海马GH-GHR/IGF-1轴的功能改善学习记忆能力，但相关机制有待进一步探讨。

本研究中使用的丝胶，为蚕茧中占25%～30%的水溶性蛋白，但在缫丝的时候被丢弃，造成了巨大的浪费。本课题组对丝胶抗DM的研究，不但可为临床治疗DM提供新思路，也可以避免浪费大量优质的蛋白质，对蚕业产品的有效利用及新产品的开发将具有较好的促进作用。

1Li HY,Wang XC,Xu YM,etal.Berberine improves diabetic encephalopathy through the SIRT1/ER stress pathway in db/db mice〔J〕.Rejuvenation Res,2017;doi:10.1089/rej.2017.1972〔Epub ahead of print〕.

2Li J,Zhang L,Li JJ,etal.Effects of estrogen on learning-memory and expression of calbindin-D28K in hippocampus in vascular dementia rats〔J〕.Pak J Pharm Sci,2017;30(4 Suppl):1403-6.

3付秀美，钟美蓉，付文亮，等.丝胶对2型糖尿病大鼠血糖和血脂的影响〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(1)：103-5.

4Song CJ,Yang ZJ,Tang QF,etal.Effects of sericin on the testicular growth hormone/insulin-like growth factor-1 axis in a rat model of type 2 diabetes〔J〕.Int J Clin Exp Med,2015;8(7):10411-9.

5杨振军，刘东慧，宋成军，等.结缔组织生长因子在糖尿病大鼠肾脏损伤中的作用及丝胶的干预效果〔J〕.中国老年学杂志，2014;34(24)：6994-6.

6Pérez-Ibave DC,Rodríguez-Sánchez IP,Garza-Rodríguez Mde L,etal.Extrapituitary growth hormone synthesis in humans〔J〕.Growth Horm IGF Res,2014;24(2-3):47-53.

7吴天成，兰海楠，马思慧，等.生长激素受体介导的信号转导机制研究进展〔J〕.中国畜牧兽医，2014;41(12)：186-9.

8张明哲，叶 丹，张志和，等.生长激素受体及其介导的信号转导〔J〕.细胞生物学杂志，2005;(27)：49-52.

9Raisingani M,Preneet B,Kohn B,etal.Skeletal growth and bone mineral acquisition in type 1 diabetic children;abnormalities of the GH/IGF-1 axis〔J〕.Growth Horm IGF Res,2017;34(1):13-21.

10Berryman DE,Glad CA,List EO,etal.The GH/IGF-1 axis in obesity:pathophysiology and therapeutic considerations〔J〕.Nat Rev Endocrinol,2013;9(6):346-56.

11宰国田.2型糖尿病慢性并发症与血清生长激素关系探讨〔J〕.现代医药，2004;20(14)：1325-6.

12Meinhardt U,Eblé A,Besson A,etal.Regulation of growth-hormone-receptor gene expression by growth hormone and pegvisomant in human mesangial cells〔J〕.Kidney Int,2003;64(2):421-30.

13Chandrashekar V,Dawson CR,Martin ER,etal.Age-related alterations in pituitary and testicular function in long-lived growth hormone receptor gene-disrupted mice〔J〕.Endocrinology,2007;148(12):6019-25.

14Wang Y,Wang W,Li D,etal.IGF-1 alleviates NMDA-induced excitotoxicity in cultured hippocampal neurons against autophagy via the NR2B/PI3K-AKT-mTOR pathway〔J〕.J Cell Physiol,2014;229(11):1618-29.