肝癌大鼠肝组织中Treg细胞及TGF-β1表达变化及相关性

房新辉 杨玉秀 王长武 郭军辉

(河南省人民医院 郑州大学人民医院消化内科,河南 郑州 450002)

我国是肝癌发病率较高的国家，据相关研究报道〔1〕，在2005年～2007年，我国男性肝癌发病率在所有恶性肿瘤中排名第三，女性肝癌发病率在所有恶性肿瘤中排名第五，且肝癌的病死率极高，因此探究肝癌的相关发病机制和寻找新的治疗切入点成为目前医疗工作者研究的重点。肿瘤免疫治疗的核心思路就是增强患者的免疫功能，通过自身的免疫系统来治疗疾病，但肝癌患者体内的免疫微环境受到较严重的破坏，这对肝癌的免疫治疗带来了阻碍〔2,3〕。调节性T细胞(Treg)是一类可以调控体内自身免疫反应的T细胞亚群，其数量的变化和功能的异常均会对免疫功能造成影响，CD4+CD25+Treg细胞是Treg细胞研究较多的一个类型，CD4+CD25+Treg细胞在肝癌患者中表达异常，且对免疫功能有抑制作用〔4,5〕。转化生长因子-β(TGF-β)是一组能调节细胞生长和分化的因子，能抑制T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖〔6〕。本研究旨在探讨肝癌大鼠肝组织中CD4+CD25+Treg细胞及TGF-β1的表达情况及其相关性，以期为肝癌的免疫微环境研究提供参考。

1 材料与方法

1.1实验动物 选取无特定病原体的Wistar大鼠60只，均为雄性，体重178～216 g，平均(194.6±8.7)g，饲养环境温度在20℃，湿度58%左右，每天给予12 h光照，分笼喂养，每笼10只，正常喂养10 d。实验大鼠购于南京君科生物工程有限公司。

1.2实验仪器和药品 二乙基亚硝胺(Sigma公司，美国)，单色荧光抗体CD4-FITC、CD25-PE(BD公司，美国)，链霉亲和素-生物素复合物法(SABC)免疫组化试剂盒、TGF-β1山羊抗鼠一抗、兔抗山羊二抗(北京博奥森生物技术有限公司)，二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(湖北武汉博士德生物工程有限公司)，胚牛血清(BSA)溶液、淋巴细胞分离液、流式细胞仪(上海优宁维生物科技公司)。

1.3分组方法及动物模型 正常喂养10 d后按随机数字表法将60只大鼠随机均分为三组，分别为肝癌组(20只)、生理盐水对照组(20只)、正常对照组(20只)。其中肝癌组大鼠每周腹腔注射一次100 mg/kg的二乙基亚硝胺，连续注射8次〔7〕；生理盐水对照组大鼠每周腹腔注射一次100 mg/kg的生理盐水，连续注射8次；正常对照组正常喂养，不做任何特殊处理。

1.4CD4+CD25+Treg细胞水平测定 在建模结束后将所有大鼠处死，取其部分肝组织，剪碎后加入磷酸盐缓冲液(PBS)，2 600 r/min离心15 min，取其上层清液。加入3 ml淋巴细胞分离液，2 000 r/min离心12 min，加入4 ml PBS缓冲液，1 000 r/min离心5 min。取出100 μl肝细胞悬液，滴加单色荧光抗体CD4-FITC、CD25-PE，采用流式细胞仪检测分析CD4+CD25+Treg细胞水平。

1.5TGF-β1水平测定 采用免疫组化SABC法测定TGF-β1水平，取部分肝组织，进行常规石蜡包埋，将组织标本浸泡在二甲苯中20 min进行脱蜡处理，用无水乙醇冲洗后用蒸馏水冲洗。将切片置于10 mmol/L柠檬酸缓冲液中，用医用微波炉煮20 min，置于室温中自然冷却20 min，PBS冲洗。滴加5%BSA溶液，静置15 min，将多余的溶液甩掉，滴加50 μl一抗，37℃静置2 h，蒸馏水冲洗，PBS冲洗，甩干，滴加50 μl二抗，37℃静置20 min。蒸馏水冲洗，甩干，滴加50 μl SABC溶液，37℃静置20 min。蒸馏水冲洗，甩干，滴加适量DAB溶液，以铺满切片表面为宜，室温下静置5 min，后将组织标本浸入苏木素溶液中复染10 min，置入95%乙醇溶液浸泡5 min，置入无水乙醇浸泡5 min，重复两次，再放入二甲苯的溶液中，浸泡5 min，滴加少量中性树胶，封片晾干。采用Mias-2000病理图分析系统分析，在400倍显微镜下观察，细胞浆或细胞膜为棕黄色则可判定为阳性细胞，采用灰度值来衡量染色强度，灰度值越小代表染色强度越深，提示阳性表达越强，任意取10个区域计算阳性灰度值，最后结果取其平均值。

1.6统计学方法 应用SPSS19.0软件，计数资料采用χ2检验，计量资料，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，采用 Spearman相关性分析。

2 结 果

2.1三组大鼠建模情况 正常对照组大鼠处死前各项生命体征均表现正常，无异常死亡。生理盐水组大鼠处死前毛发光泽较差，精神状态较差，运动较少，食欲一般，对外界刺激反应较慢，无异常死亡。肝癌组大鼠处死前毛发杂乱无光泽，精神萎靡，极少运动，食欲不振，对外界刺激反应极慢，5只大鼠异常死亡。

2.2三组大鼠的CD4+CD25+Treg细胞占CD4+T细胞比例和TGF-β1表达水平对比 三组大鼠的CD4+CD25+Treg细胞占CD4+T细胞比例和TGF-β1表达水平整体比较差异有统计学意义(P<0.05)；肝癌组大鼠的CD4+CD25+Treg细胞占比显著高于正常对照组和生理盐水对照组，TGF-β1灰度值显著低于正常对照组和生理盐水对照组(均P<0.05)；生理盐水组的TGF-β1灰度值显著低于正常对照组(P<0.05)，但CD4+CD25+Treg细胞占比与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 三组大鼠的CD4+CD25+Treg细胞占CD4+T细胞比例和TGF-β1表达水平对比

与正常对照组比较：1)P<0.05；与生理盐水对照组比较：2)P<0.05

2.3肝癌组大鼠CD4+CD25+Treg细胞和TGF-β1相关性分析 肝癌组大鼠CD4+CD25+Treg细胞和TGF-β1表达水平呈明显的正相关(r=0.823，P=0.000)。

3 讨 论

肝癌可分为继发性肝癌和原发性肝癌，继发性肝癌又称转移性肝癌，系指全身多个器官起源的恶性肿瘤侵犯、转移至肝脏。原发性肝癌较为多见，系指恶性肿瘤起源于肝脏的上皮或间叶组织〔8〕。目前原发性肝癌的发病机制尚不明确，其危险因素主要有乙肝病毒感染、肝硬化、家族癌症史、酗酒、不良的饮食习惯等〔9〕。肝癌患者的免疫微环境主要由肝癌细胞周围的淋巴细胞、成纤维细胞、免疫细胞、肝星状细胞等构成，当免疫微环境正常时能对肿瘤细胞形成较大的杀伤力，能逐渐改善患者的各项生命体征，但肝癌患者体内存在较强的免疫微环境抑制，主要是肿瘤细胞为顺应其生长和转移，通过分泌免疫抑制因子来破坏免疫微环境，当免疫微环境受到抑制时肿瘤细胞获得较好的生长和转移条件，进而使得病情恶化〔10〕。有研究指出〔11〕，采用肝动脉栓塞化学治疗联合免疫治疗能有效地提高患者的免疫功能，降低血清肿瘤相关指标水平，提高生存率，由此可见从免疫微环境切入治疗肝癌是值得探索的。

CD4+CD25+Treg细胞是一类主要由胸腺产生的细胞群，主要表达为CD4分子、CD25分子和叉头蛋白3(Foxp3)。有研究报道〔12〕，将正常小鼠体内的CD4+CD25+Treg去除会导致多种自身免疫性疾病，而将其回输则可避免免疫性疾病的发生，从而证明该细胞群具备免疫调节能力。CD4+CD25+Treg细胞可抑制自身免疫反应，在正常人体内能通过其免疫抑制调节功能来防止免疫反应扩大和过度免疫反应，从而维持正常的免疫功能，避免发生免疫性疾病，在机体出现微生物感染、过敏反应时CD4+CD25+Treg细胞都可以起到重要的免疫调节作用。有研究表明〔13〕，正常情况CD4+CD25+Treg细胞占CD4+T细胞比例在5%～10%的范围内，但在肝癌患者中其占比明显上升，可能直接或间接促进了肿瘤的发展。本研究说明CD4+CD25+Treg细胞在肝癌大鼠病理组织中呈现高表达，这提示高表达的CD4+CD25+Treg细胞可能会对免疫微环境产生负面的影响，过度抑制免疫反应，导致肿瘤细胞获得更好的生存条件。CD4+CD25+Treg细胞对免疫反应的抑制机制可有以下几点〔14〕：①通过分泌白细胞介素(IL)10、TGF-β等因子来对免疫功能进行调节；②通过释放颗粒酶和穿孔素对效应细胞形成杀伤；③以半乳糖凝集素为媒介与T细胞表面的糖蛋白受体发生反应，从而减少T细胞分泌IL-2 和γ干扰素；④Foxp3和T细胞发生作用，抑制效应T细胞和自然杀伤细胞的活性。本次研究提示TGF-β1在肝癌大鼠肝癌组织中呈现高表达。TGF-β1具有抑制T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖的作用，从而对机体的免疫功能产生抑制，此外，TGF-β1还能诱导Foxp3表达，使得部分CD4+CD25+初始T细胞转化为CD4+CD25+Treg细胞，进一步增加肝癌中CD4+CD25+Treg细胞水平，而CD4+CD25+Treg细胞又可分泌TGF-β1，进而导致两者数量相互促进〔15〕。本研究显示两者呈正相关也印证了这一点。

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