补肾祛痰法对膝骨性关节炎模型大鼠血清及关节液中炎症因子的影响

郑炜宏 唐剑邦 高大伟 吴宇峰 何君源 黄子奇

(中山市中医院骨三科，广东 中山 528400)

膝骨性关节炎(OA)是一种由多因素导致的慢性退行性膝关节疾病，其主要病理特征是膝关节软骨破坏、丢失及硬化等，甚至出现囊性病变并形成骨赘，导致关节肿胀、剧痛，其病变范围还包括关节周围骨骼、肌肉、韧带和滑膜，关节功能出现进行性功能障碍。OA在人群中的发病率非常高，尤其在老年人群中其发病率已经超过37%〔1〕。既往OA的治疗以镇痛为主，治疗带来的胃肠道副作用较大〔2〕。OA在中医学上属于“痹病”范围，主要病因是肝肾亏虚、筋骨失养、外邪痹阻，有痰、瘀之表现，现代生理学发现关节滑液可以润滑和营养关节腔，而中医理论认为津液化而为痰，推断关节液与痰存在一定联系〔3〕。本次研究采用补肾祛痰方治疗大鼠OA模型，并分析其对大鼠血清及关节液炎症因子水平的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级健康SD大鼠32只(由广州中医药大学动物实验中心提供)，体重180～220 g。大鼠采用标准饲料进行科学无菌喂养，饮水自由。

1.2药物制备 本研究采用补肾祛痰方进行治疗，主要药物包括陈皮15 g、骨碎补15 g、续断15 g、熟地黄15 g、杜仲15 g、川芎10 g、苍术10 g、川牛膝10 g、法半夏10 g、甘草5 g。药物均用水煎服，由院内中药制剂室提供。

1.3方法

1.3.1分组与造模 OA模型建立采用改良的Hulth法〔4〕，10%水合氯醛溶液，注射剂量为0.33 ml/100 g。手术造模过程需要严格坚持无菌操作，手术采用膝关节内侧纵切口，检查关节腔内无原发病变，随后将大鼠膝关节前后交叉韧带、内侧副韧带、内侧半月板切断，手术过程中切勿损伤关节软骨，进行抽屉试验阳性后彻底止血，关节腔止血，并将少量青霉素溶液注入关节腔内，逐层缝合关节囊及皮肤，患处采用无菌敷料包扎，并不进行固定。大鼠行膝骨关节术后每日用青霉素40×104U肌肉注射，无菌敷料进行换药，预防出现感染等并发症。依据以往经验，超疲劳活动能够使得OA提前发病〔5〕。因此，大鼠手术后1 w进行每日30 min强迫活动，持续4 w后则可以得到稳定OA模型。造模成功后，按照随机数字表法将大鼠分为对照组、模型组、中药组及西药组，每组8只，对照组大鼠则仅将膝关节切开，韧带并不切断。

1.3.2治疗方法 大鼠在完成造模后第4周进行药物治疗，主要采用灌胃给药。中药组采用补肾祛痰法中药制剂灌服，模型组及对照组大鼠灌服等量生理盐水，西药组大鼠则采用美洛昔康0.45 mg/kg灌服。药物灌服治疗每日1次，持续治疗4 w〔6〕。

1.4观察指标 ①基本情况观察：主要观察指标包括大鼠毛发光泽程度、进食量、体重变化、精神状态及活动量情况；②血液、关节液炎症因子测定：实验结束后腹腔取血4 ml，置于涂有肝素钠的采血管中，3 500 r/min，离心10 min，吸取上清液即得血浆。另外抽取关节积液2 ml，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测白细胞介素(IL)-1、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α〔7〕；③步态的评价〔8〕：实验大鼠在药物治疗8 w后观察每日步态，步态状况参考Coderre法进行分级〔8〕，共4级：0级：实验大鼠能够正常行走；Ⅰ级：大鼠出现轻度的跛行，膝关节以下略弯曲；Ⅱ级：大鼠出现中度跛行，患肢仅能触到地面；Ⅲ级：大鼠重度跛行，患肢略微离开地面，其余3足着地行走；④膝关节周长测量：在最后一次灌服药物后30 min，麻醉各组大鼠，膝关节周长采用软尺进行测量，手术膝关节与正常膝关节进行对比，计算肿胀率〔9〕，肿胀率(%)=(手术膝关节周长-正常膝关节周长)/正常膝关节周长×100%。

1.5统计学方法 应用SPSS20.0软件，计量数据采用t检验，多组间比较采用独立样本方差分析；计数资料组间比较采用χ2检验。

2 结 果

2.1大鼠基本情况 对照组大鼠毛发光亮，进食正常，体重和精神状态、活动量无变化；模型组大鼠毛发暗淡，进食量和体重下降，活动量下降；中药组和西药组大鼠毛发光亮度一般，进食量逐渐恢复正常，活动量逐渐恢复。

2.2步态的评价 实验大鼠在药物治疗后第8周观察步态，对照组大鼠表现正常，0级8只；模型组大鼠跛行严重，Ⅲ级7只，Ⅱ级1只；中药组和西药组大鼠步态均出现不同程度改善，中药组0级2例，Ⅰ级5例，Ⅱ级1例；西药组0级1例，Ⅰ级4例，Ⅱ级2例，Ⅲ级1例。

2.3膝关节周长对比 对照组大鼠膝关节周长处在正常范围内，模型组大鼠膝关节周长显著高于中药组、西药组和对照组(P<0.05)，中药组、西药组与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)，中药组、西药组、模型组大鼠肿胀率高于对照组(P<0.05)，中药组、西药组大鼠肿胀率低于模型组(P<0.05)，中药组和西药组大鼠的膝关节周长和肿胀率差异无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 补肾祛痰法治疗膝关节炎大鼠膝周长的影响

与对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05，下表同

2.4血清及关节液炎性因子水平对比 与对照组相比，中药组、西药组、模型组大鼠血清及关节液内IL-1、IL-6及TNF-α水平均显著升高(P<0.05)；中药组和西药组大鼠血清及关节液内IL-1、IL-6及TNF-α水平低于模型组(P<0.05)；中药组与西药组各项指标对比无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 补肾祛痰法治疗OA大鼠血清和关节液炎性因子的影响

3 讨 论

现代医学认为膝OA是一种慢性退行性关节病变，主要涉及膝关节软骨、软骨下骨质并形成关节软骨的骨赘，其发病机制尚未完全明确。关节软骨主要是由软骨细胞、基质两部分组成，致病因素主要是对这二者进行影响，从而导致病情出现。病理学研究表明〔10〕，IL-1主要是干扰关节软骨细胞代谢，促使关节软骨降解。TNF-α与IL-1协同作用，同时还能够诱导生成IL-6，在OA等疾病的发生、发展过程中起着重要作用。相关研究表明〔11〕，在关节腔内IL-1、IL-6及TNF-α表达水平增加，且因子水平与炎症严重程度存在正相关关系，可以作为疾病程度的参考指标。在传统中医学说中，膝OA均属于“痹证”范畴，经典中医理论认为膝OA与患者劳损、体衰、风寒、湿邪存在密切关系，具体表现为肝肾亏虚、痰瘀互结，肾虚与血瘀二者相互作用，在疾病进展过程中始终发挥重要作用，最终成痹。而关节腔内含关节液，发挥润滑作用，中医认为关节液属“津液”，津液在病理状态下代谢则成为痰，因而中医理论认为〔12〕关节积液和痰之间存在联系。本质为气虚阳虚，多痰、多湿则是表象。膝OA患者缺少运动锻炼，导致肥胖提醒居多，脾失健运，使得肝肾两虚，水无归源，留则显湿，发而生痰，痰随气升，连通腹脏，进而侵及筋骨关节。痰湿淤积，气血不畅。因此，本研究采用中医补肾祛痰法进行治疗，药方内主要药物成分中，苍术、陈皮、半夏等具有化痰除湿的功效，杜仲、熟地黄、牛膝、续断等药物则发挥强筋健骨、益气补肾等作用，川芎则具有止痛活血的功能，兼有除湿行气的效用，而甘草则能调节各药性能，使其各自发挥作用，共同具备补肾祛痰的效果〔13〕。

本次动物实验表明补肾祛痰法药剂能够有效抑制关节软骨退变，缓解滑膜炎症。OA作为一种关节退行性病变，发病过程与肾具有紧密联系，补肾是治疗OA的关键疗法，肾气足则表明机体骨骼健壮，组方中的杜仲、熟地黄、牛膝、续断能够强健筋骨，补益肾脏；此外有学者认为血瘀是OA发病的病因之一，肾是先天之本，肾亏则容易导致血流不畅，在关节中形成阻滞，导致关节失去营养支持，同时还会造成风湿痹痛，组方中川芎发挥止痛活血的功效；另外OA患者的致病原因还有湿热和痰瘀，外湿在关节处积聚成痰，侵袭关节和经络，使得关节肿痛和变形等，方中的苍术、陈皮、半夏主要起化痰除湿的作用〔14〕。除此之外，现代药理学研究分析其作用机制是补肾祛痰药剂中的有效成分能够抑制释放软骨细胞、滑膜内炎性因子，使得软骨细胞代偿能力有效提高，软骨细胞周围代谢环境改善，在一定程度上缓解软骨退变〔15〕。补肾祛痰法药剂能够发挥西药同等效果。

综上所述，补肾祛痰法能够有效改善OA大鼠跛行状况，能够消除肿胀膝关节，更重要的是补肾祛痰法药剂能够有效抑制膝骨性关节炎细胞因子IL-1、IL-6、TNF-α水平，减轻炎性症状，其临床作用需要进一步进行训练。

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