白细胞介素-17对老年类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞增殖和趋化因子分泌的影响及作用机制

陈向华 王建吉 耿学丽 丁 萌 陶晓明 武英伟 张秀琴

(承德医学院附属医院检验科，河北 承德 067000)

滑膜增生及关节软骨破坏是类风湿关节炎(RA)的主要病理特征，滑膜成纤维细胞是RA滑膜中的主要成分，在病情进展中起重要作用〔1〕。白细胞介素(IL)-17是最新发现的由角质形成细胞、成骨细胞等分泌的细胞因子〔2〕。研究显示，RA患者血清中IL-17含量增加，与病情发展相关〔3〕，但对滑膜成纤维细胞的免疫调节作用仍未明确。老年人因免疫和器官功能衰退，对目前RA治疗药物副作用的敏感性较强。本研究拟分析IL-17对RA患者成纤维细胞增殖和趋化因子分泌的影响及机制。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 选取2016年1～6月在承德医院院附属医院行关节置管术的老年RA患者，本研究经伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。DMEM细胞培养基、胰酶、胎牛血清(FBS)购于上海杰美基因医药科技有限公司；IL-17、IL-17受体(IL-17R)、同型对照抗体购于上海雅吉生物科技有限公司；蛋白芯片试剂盒(AAH-CYT-1000)购于北京华夏远洋科技有限公司；MEK1/2信号通路抑制剂PD98059、核转录因子(NF)-κB信号通路抑制剂LY294002、STAT3信号通路抑制剂AG490，RANKL信号通路抑制剂小白菊内酯均购于上海一飞生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1滑膜成纤维细胞分离与培养 取术中切除的新鲜滑膜组织，剔除表面纤维和脂肪组织，剪成边长为1 mm的正方体小块，5 mg/ml胶原酶消化60 min，滤去组织残渣，将细胞悬液3 000 r/min离心10 min，弃去上清液，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后用含10% FBS的DMEM细胞培养液孵育24 h，弃去悬浮细胞，每3 d换1次培养液，90%以上细胞融合后进行传代，选取5～6代细胞进行试验。

1.2.2滑膜成纤维细胞增殖检测 取患者对数生长期滑膜成纤维细胞接种到24孔板中，CO2孵箱中培养48 h后滴加IL-17(终浓度为100 ng/ml)，并设置对照组和空白组。分别于培养0、24、48、72、96、120 h后滴加100 μl/孔3-(4,5-二甲噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)，孵育6 h后弃去上清，滴加500 μl/孔二甲基亚砜(DMSO)，混合均匀后吸入96孔板，450 nm处读取各孔的吸光度值(OD值)，刺激指数=(研究组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)。

1.2.3滑膜成纤维细胞上清液趋化因子检测 培养患者长期滑膜成纤维细胞，滴加IL-17终浓度为100 ng/ml并设置对照组，CO2孵箱中培养48 h，收集上清。使用蛋白芯片试剂盒检测滑膜成纤维细胞上清液趋化因子中性粒细胞激活肽(ENA)-78、IL-8、生长相关癌基因(GRO)、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1的水平，操作按试剂盒说明进行。使用激光扫描仪扫描信号并用软件进行分析。

1.2.4滑膜成纤维细胞表面IL-17R检测 用流式细胞术进行分析，将滑膜成纤维细胞按1×105密度接种到6孔板中，培养至细胞贴壁生长90%以上，胰酶消化后转入5 ml的EP管中3 000 r/min离心10 min，弃去上清后加入400 μl PBS混匀，将重悬的细胞平均分为2份，一份滴加抗IL-17R抗体10 μl，另一份滴加同型对照10 μl，并在4℃暗室中反应40 min，PBS冲洗后重悬细胞，用流式细胞仪检测。

1.2.5IL-17影响滑膜成纤维细胞趋化因子分泌的信号通路 将成纤维细胞接种到培养皿表面，培养至细胞覆盖面积>95%时，在不同培养皿上分别滴加50 μmol/L PD98059、LY294002、AG490及20 μmol/L小白菊内酯孵育60 min，滴加10 ng/ml的IL-17后孵育72 h，去上清，同时设置空白对照组(仅滴加10 ng/ml的IL-17)。采用荧光定量PCR法检测ENA-78 mRNA、IL-8 mRNA、GRO mRNA、MCP-1 mRNA的表达水平。

1.3统计学分析 使用SPSS20.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1不同时间点滑膜成纤维细胞增殖情况 IL-17刺激滑膜成纤维细胞0、24、48、72、96、120 h后刺激指数(1.000±0.000、0.005±0.010、1.042±0.035、1.225±0.028、1.089±0.006、1.060±0.042)差异均有统计学意义(P<0.05)，其中刺激72 h时滑膜成纤维细胞增殖能力最强。

2.2IL-17对滑膜成纤维细胞趋化因子表达的影响 IL-17刺激滑膜成纤维细胞48 h后，滑膜成纤维细胞分泌ENA-78(386.15±9.30)、IL-8(2 128.51±45.93)pg/ml、GRO(4 824.83±155.59)mmol/ml、MCP-1(6 821.68±506.14)水平均明显高于对照组〔(55.36±3.81)、(784.95±97.57)pg/ml、(2 857.15±194.37)mmol/ml、(2 814.72±335.90)，P<0.05〕。见图1。

图1 RA患者滑膜成纤维细胞趋化因子蛋白芯片检测

2.3滑膜成纤维细胞表面IL-17R表达情况 流式细胞术检测显示，加入抗IL-17R抗体组IL-17R表达百分比〔(0.79±0.17)%〕明显高于对照组〔(0.25±0.08)%，P<0.05〕。

2.4IL-17通过MEK1/2、NF-κB、STAT3信号通路诱导滑膜成纤维细胞趋化因子表达 滴加PD98059、LY294002、AG490后，ENA-78、IL-8、GRO、MCP-1 mRNA表达量均明显低于空白对照组(P<0.05)；而滴加小白菊内酯后与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 滴加不同信号通路抑制剂后滑膜成纤维细胞上清液趋化因子表达

与空白对照组比较：1)P<0.05

3 讨 论

研究发现，滑膜成纤维细胞是滑膜组织中最活跃的细胞，在RA发病过程中发挥重要作用〔4〕。在RA发病早期的免疫反应中，机体免疫应答激活后，滑膜成纤维细胞可通过自分泌、旁分泌方式释放出细胞因子、趋化因子等活性介质，引发炎性反应，导致骨组织和软骨组织进行性破坏〔5〕；同时，T细胞循环代谢速度增加，中性粒细胞和巨噬细胞分泌出更多炎性细胞，加速了滑膜成纤维细胞和破骨细胞的活化进程〔6〕。

IL-17是近年新发现的细胞因子，具有神经保护、免疫调节等功能。RA患者关节滑液中IL-17水平增加并与白细胞数之间呈明显相关性。相关研究显示，在多种关节炎滑膜组织中均存在IL-17表达，其中RA患者IL-17表达量明显高于骨性关节炎(OA)等其他患者〔7〕；同时IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α通过激活JNK/NF-κB信号通路，上调RA患者滑膜成纤维细胞中IL-17 mRNA表达〔8〕。以上研究提示，IL-17在RA炎性反应及骨破坏中起到重要调控作用。

本研究显示，IL-17可明显促进RA患者滑膜成纤维细胞增殖，且IL-17刺激的滑膜成纤维细胞分泌ENA-78、IL-8、GRO、MCP-1明显增加；ENA-78、IL-8均属于CXC亚群趋化因子，其中ENA-78作为多源细胞因子，在炎性因子作用下由成纤维细胞、单核细胞、血管内皮细胞等合成、分泌，与CXC趋化因子受体(CXCR)2相结合后可上调细胞间黏附分子(ICAM)-1和蛋白的表达，诱导中性粒细胞渗出，抑制炎症和免疫反应。IL-8可趋化嗜酸性粒细胞和中性粒细胞并诱导脱颗粒，提升炎症反应程度和细胞吞噬能力，还能调控淋巴细胞再循环，增加对变性IgG的抑制作用。GRO家族包括GROα～δ，而CXCR2是其共同的受体，其中GROα与受体结合力最强；GRO与受体结合后可诱发颗粒酶和超氧化物的释放并参与组织损伤定位。MCP-1由炎性细胞合成，属于CC亚群趋化因子，与受体结合后可活化T细胞、巨噬细胞，参与RA的炎症反应。本研究结果提示MEK1/2、NF-κB、STAT3信号通路作为细胞趋化因子表达的上游激活剂，参与IL-17诱导的细胞趋化因子分泌。

1王博雯.过表达IL-37b基因对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖的影响〔D〕.武汉：华中科技大学,2015.

2Chu Y,Wang F,Zhou M,etal.A preliminary study on the characterization of follicular helper T(Tfh) cells in rheumatoid arthritis synovium〔J〕.Acta Histochem,2014;116(3):539-43.

3Guo X,Pan Y,Xiao C,etal.Fractalkine stimulates cell growth and increases its expression via NF-κB pathway in RA-FLS〔J〕.Int J Rheum Dis,2012;15(3):322-9.

4黄 凰.慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者治疗前后心理健康状况对比分析〔J〕.中国卫生工程学,2016;(6):633-4.

5Huang QQ,Pope RM.The role of glycoprotein 96 in the persistent inflammation of rheumatoid arthritis〔J〕.Arch Biochem Biophys,2013;530(1):1-6.

6Celikyay F,Yuksekkaya R,Inanir A,etal.Multidetector computed tomography findings of the sternoclavicular joint in patients with rheumatoid arthritis〔J〕.Clin Imag,2013;37(6):1104-8.

7孙 波,宋玉国,王 华,等.类风湿关节炎患者关节液中IL-17的定量检测〔J〕.北华大学学报(自然科学版),2014；15(5):620-2.

8齐 晅,田 玉,孙 超,等.NF-κB信号通路的阻断对类风湿关节炎滑膜细胞凋亡与炎症的影响〔J〕.中国老年学杂志,2015;35(24):7022-4.