依达拉奉对一氧化碳中毒后大鼠脑组织HO-1和NRF-2表达的影响

吴展兴 许林勇

(深圳市第二人民医院急诊科，广东 深圳 518035)

一氧化碳(CO)中毒属于临床常见的气体中毒病症，其造成的死亡率长期居于急性中毒种类的首位。有报道指出，氧化应激是CO中毒后脑损伤的一种重要致病机制〔1〕。核转录因子红细胞2相关因子(NRF-2)是近年来发现的一类对于氧化应激较为敏感的基因转录性因子，其属于Keapl-NRF-2/ARE这一抗氧化系统的重要分子。而血红素加氧酶(HO)-1是一种微粒体酶，在细胞核组织进入应激状态时，HO-1能够作为保护性的蛋白而被诱导，抑制机体中细胞因子所介导的相关凋亡状态〔2〕。依达拉奉属于新型自由基清除剂，可有效清除活性氧及有细胞毒性的羟自由基，从而抑制脂质的过氧化，避免了血管内皮细胞的损伤，最终抑制了迟发性神经细胞的死亡进程。本研究旨在探讨依达拉奉对CO中毒后大鼠脑组织HO-1和NRF-2表达的影响及其作用机制。

1 材料和方法

1.1动物分组 选择本院实验室饲养的雄性健康清洁级SD大鼠90只，体重200～260 g，平均(234.63±12.33)g。清洁环境中正常饲养7 d后按照随机数字表法将其分成对照组、中毒组及治疗组各30只。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

1.2模型制作方法 将中毒组及治疗组大鼠首先制作CO中毒模型：在密闭的DWC 450-1150动物实验高压氧舱(上海701所)中放入大鼠，大鼠呼吸体积分数1 000 ppmin CO气体40 min，然后追加CO气体，用体积分数3 000 ppm再处理20 min至大鼠的意识丧失后，将其移至舱外，即刻用3%的戊巴比妥行腹腔注射麻醉，自左侧的股动脉抽取0.3 ml的全血，应用产自丹麦雷度公司的ABL800型血气分析仪检测碳氧血红蛋白(HbCO)水平。若动脉血HbCO≥40%，则表明大鼠中毒模型已制作成功。实验过程中应用恒温动物毯确保大鼠的体温为36℃～37℃。

1.3干预过程 对照组大鼠呼吸1 h新鲜空气之后腹腔注射3 mg/kg生理盐水。中毒组及治疗组大鼠则在中毒后予以高压氧治疗，1次/d，直到处死。同时对中毒组大鼠于高压氧治疗之后1 h行等量生理盐水的腹腔注射，而治疗组大鼠则于高压氧治疗之后1 h行10 mg/kg的依达拉奉腹腔注射，2次/d，直到处死。

1.4免疫组化检测HO-1及NRF-2阳性细胞的表达 分别在干预1 d、3 d及5 d时取各组的10只大鼠，将其处死后提取大脑，制成石蜡切片。兔抗大鼠NRF-2及HO-1的单克隆抗体均产自美国的Santa Cruz公司，其一抗的稀释浓度是1∶100及1∶200。于400倍光镜下发现细胞质亦或细胞核内有棕黄色颗粒时记为阳性细胞。用于阴性对照的切片无需添加一抗，并用0.01 mol/L的PBS代替，无阳性反应表明一抗特异性较强。对每只大鼠分别测定4张连续切片，于400倍光镜下检测大脑皮质区的4个随机视野，通过德国Leica公司生产的LEICA Qwin图像处理系统检测各视野的吸光度值，并计算平均值。

1.5Western印迹法测定HO-1及NRF-2蛋白的表达 对各组在干预1 d、3 d及5 d时提取的大鼠大脑，选用100 g脑组织经RIPA法将总蛋白提取出来，制备出SDS-PAGE凝胶，再加样电泳，经半干法转移到纤维素膜上，使膜浸于含有100 g/L脱脂奶粉TBST封闭液下室温放置1 h，并放在由TBST配制的NRF-2为1∶550，HO-1为1∶600(均产自美国Santa Cruz公司)的一抗稀释液及4℃条件下过夜，而后放于HRP标记的1∶1 000的二抗稀释液处于室温下2 h。将膜放在X光片盒内曝光3 min，并显影40 s，再定影2 min，之后水洗5 min，任一步骤均需充分水洗，防止非特异性的染色。通过Bio-Rad 2000型凝胶成像系统对光片扫描之后，利用Quantity one软件实施吸光度值分析。

1.6观察指标 对比各组干预1 d、3 d及5 d时脑皮质区HO-1及NRF-2阳性细胞及蛋白的相对吸光度值，分析CO中毒大鼠脑组织HO-1及NRF-2蛋白表达的关系。

1.7统计学方法 应用SPSS21.0软件行χ2、t检验。

2 结 果

2.1各组脑皮质区HO-1及NRF-2阳性细胞的相对吸光度值对比 干预1 d、3 d及5 d时治疗组及中毒组脑皮质区HO-1及NRF-2阳性细胞的相对吸光度值均高于对照组，且治疗组显著高于中毒组(P<0.05)。治疗组及中毒组干预3 d和5 d时的HO-1及NRF-2阳性细胞的相对吸光度值均高于干预1 d时，且干预5 d 时的水平显著高于3 d(P<0.05)。见表1。

2.2各组脑皮质区HO-1及NRF-2蛋白的相对吸光度值对比 干预1 d、3 d及5 d时治疗组及中毒组脑皮质区HO-1及NRF-2蛋白的相对吸光度值均高于对照组，且治疗组显著高于中毒组(P<0.05)。治疗组及中毒组干预3 d和5 d时的HO-1及NRF-2蛋白的相对吸光度值均高于干预1 d时，且干预5 d时的水平显著高于3 d(P<0.05)。见表2。

2.3中毒组及治疗组CO中毒大鼠的脑组织HO-1及NRF-2蛋白表达的关系分析 中毒组及治疗组CO中毒大鼠的脑组织HO-1及NRF-2蛋白能够同时定位在单个细胞中，也能在不同细胞中表达。见图1。

表1 各组脑皮质区HO-1及NRF-2阳性细胞的相对吸光度值对比

与对照组相比：1)P<0.05；与中毒组相比：2)P<0.05；与干预1 d相比：3)P<0.05；与干预3 d相比：4)P<0.05，下表同

表2 各组脑皮质区HO-1及NRF-2蛋白的相对吸光度值对比

A：HO-1蛋白表达图；B：NRF-2蛋白表达图；C：共同视野中HO-1及NRF-2蛋白的位置关系图1 CO中毒大鼠的脑组织HO-1及NRF-2蛋白表达的关系

3 讨 论

当人体吸入过量CO之后，进入体内的CO立刻与血红蛋白相结合，而后产生HbCO，导致相关组织发生缺氧缺血，最终产生各类临床症状。而人体的中枢神经系统若缺血缺氧，则可能进一步危害脑组织的结构及功能，如神经元细胞器的结构受损，线粒体的氧化磷酸化等功能变弱或停止，从而造成能量代谢过程出现障碍，使得细胞膜电解质代谢紊乱，同时激发级联反应，最终致使细胞凋亡而丧失相关功能〔3，4〕。近年来发现，氧化应激可能与脑损伤之间存在一定联系〔5〕。HO是一种微粒体酶，而NFR-2对于氧化应激过程则是一类重要的调节性因子。由于依达拉奉可有效地抑制脂质的过氧化，保护血管内皮，分析依达拉奉对于HO-1及NRF-2在CO中毒后大鼠脑组织中的表达变化，有助于为临床治疗提供数据支持。

本研究发现，HO-1及NRF-2在CO中毒后大鼠脑组织中的表达明显上升，且经依达拉奉治疗后二者的表达水平明显更高。分析原因，主要是因为依达拉奉能够较好地抑制脑组织细胞的凋亡过程，而HO-1及NRF-2可能参与此种抑制过程的作用机制当中〔6，7〕。具体而言，正常大鼠脑组织内存在较低水平的HO-1及NRF-2蛋白的表达，此时机体能够维持二者的蛋白质转录、翻译及降解的平衡，同时调节了“氧化-抗氧化”这一系统的相对平衡。而发生CO中毒之后，HO-1及NRF-2发生早期激活及高表达则可能属于机体的一种内源性和适应性的自我保护机制，然而此种代偿能力相对有限，若不及时给予治疗则会引起脑组织在中毒后发生超微结构的损伤和细胞凋亡，以及相关神经功能的丧失〔8，9〕。由于依达拉奉的抑制凋亡作用，致使NRF-2自细胞质的分子伴侣Keap1当中被分离，并转运至细胞核，从而上调了HO-1和下游基因的相关表达，最终使机体发挥了更好的抗氧化应激能力，而这对CO中毒后的脑损伤过程产生了较好的神经保护作用。相关报道指出，依达拉奉通过促进HO-1及NRF-2蛋白的相关表达进程，参与到Keap1-NRF-2/ARE通路，从而对中毒后脑损伤组织产生了神经保护作用〔10，11〕。

同时，本文发现，CO中毒大鼠的脑组织HO-1及NRF-2蛋白能够同时定位在单个细胞中，也能在不同细胞中表达。提示HO-1及NRF-2之间并无十分明显的调节关系，原因可能在于HO-1及NRF-2蛋白可在CO中毒后的脑组织内经由一个或多个途径被激活，因此HO-1及NRF-2虽然在中毒后具有一定的协同表达，但二者之间并无十分明显的联系〔12，13〕。

综上所述，HO-1及NRF-2蛋白在CO中毒后大鼠脑组织中的表达上升，依达拉奉对于二者表达具有明显的提升作用。

1张艳敏，陈惠敏，刘莎莎，等.大株红景天、依达拉奉联合高压氧治疗急性一氧化碳中毒迟发脑病疗效观察〔J〕.现代中西医结合杂志，2016；25(10)：1113-5.

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7Kitamoto T，Tsuda M，Kato M，etal.Risk factors for the delayed onset of neuropsychologic sequelae following carbon monoxide poisoning〔J〕.Acute Med Surg，2016；3(4)：315-9.

8Qingsong W，Yeming G，Xuechun L，etal.The free radical scavenger，edaravone，ameliorates delayed neuropsychological sequelae after acute carbon monoxide poisoning in rabbits〔J〕.Undersea Hyperb Med，2013；40(3)：223-9.

9刘 磊，蒋小建，樊菲菲，等.依达拉奉缓解大鼠急性一氧化碳中毒所致脑损伤机制探讨〔J〕.解放军医药杂志，2016；28(8)：6-9.

10李 琴，程永梅，毕明俊，等.依达拉奉对一氧化碳中毒后脑损伤的神经保护作用及机制研究〔J〕.中华神经医学杂志，2015；14(8)：810-6.

11Li Q，Bi MJ，Bi WK，etal.Edaravone attenuates brain damage in rats after acute CO poisoning through inhibiting apoptosis and oxidative stress〔J〕.Environ Toxicol，2016；31(3)：372-9.

12李 琴，毕明俊，康 海，等.依达拉奉对急性一氧化碳中毒大鼠脑组织超微结构及抗氧化因子表达的影响〔J〕.中华航海医学与高气压医学杂志，2015；22(5)：341-6.

13郑 然，李 琴，邹 勇，等.Nrf-2在一氧化碳中毒性脑损伤发病机制中的作用研究进展〔J〕.医学综述，2016；22(21)：4186-9.