舒肝颗粒对抑郁大鼠海马神经元凋亡、脑组织caspase-3蛋白及外周血中细胞因子水平的影响

汤光花 陈永新 张瑞岭

(新乡医学院第二附属医院药学部，河南 新乡 453002)

抑郁症基本临床表现为持久的心境低落、思维和行为异常的综合征，患者易出现自卑忧郁、情绪低落、悲观厌世，甚至自杀倾向和行为，属于情感性精神障碍疾病。抑郁症与失业、贫困、学习、情感、挫折等因素相关，随着社会发展和生活节奏加快，发病率逐年上升，成为常见病和多发病〔1,2〕。抑郁症发病复杂，可能与大脑神经递质减少导致心理和精神活动低下有关，可能与激素异常导致炎症细胞因子升高等有关〔3〕。抑郁症的治疗药物有氟西汀、地昔帕明、马普替林等，但易引起多种副作用，临床应用受到限制〔4〕。中医认为抑郁症是由气机郁滞、情志不舒导致，病因为情志内伤，病机为忧思郁怒，肝气郁结，治宜理气开郁，调畅气机为主〔5〕。舒肝颗粒具有舒肝理气，散郁调经之功，治疗抑郁症有较好的临床疗效，但其机制不清〔6〕。本文研究舒肝颗粒对抑郁大鼠海马神经元凋亡、脑组织caspase-3蛋白及外周血中细胞因子水平的影响，探讨其作用机制。

1 资料与方法

1.1实验动物 SD大鼠，雄性，体重(200±20)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。在(23±2)℃环境中采用12 h昼夜节律饲养，研究过程中自由饮水进食，白天(9：00～17：00)进行试验研究。适应性喂养7 d后，选择敞箱实验评分相近的40只大鼠随机分为对照组、模型组、舒肝组和氟西汀组各10只。

1.2药品与试剂 舒肝颗粒，昆明中药厂有限公司，生产批号：20151026；氟西汀，美国礼来公司，生产批号：L01984；羧甲基纤维素钠和caspase-3试剂盒购于英国Abcam 公司；肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-2和IL-8试剂盒购于武汉华美生物工程有限公司；TUNEL 凋亡试剂盒和二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购于碧云天生物科技有限公司；磷酸盐缓冲液(PBS)和二抗购于宝生物工程有限公司；其他试剂均购于国药集团化学试剂有限公司；实验用水为超纯水。

1.3实验仪器 LDZ-2 型低速离心机(北京京立离心机有限公司)；WGY-10型分分光光度计(天津光学仪器有限公司)；Mini-PROTEAN3电泳、ELx800酶标仪及Mini-PROTEAN3 电转移系统(美国伯腾仪器有限公司)；电子天平(瑞士梅特勒公司)；超低温冰箱(合肥美菱股份有限公司)；倒置x51显微镜(日本奥林巴斯有限公司)。

1.4模型建立 对照组正常饲养。将模型组、舒肝组和氟西汀组单笼孤养，在饲养的21 d中给予慢性轻度不可预见性应激，包括60 s高速水平震荡和夹尾、24 h禁水、48 h禁食30 min悬吊、45℃条件下5 min热应激、4℃条件下5 min冷刺激、 昼夜颠倒等不可预见性应激。模型组自由饮水进食，舒肝组第2天开始灌服舒肝颗粒，剂量200 mg/kg，氟西汀组第2天开始灌服氟西汀，剂量1.2 mg/kg，舒肝组和氟西汀组每天灌胃1次，连续20 d。

1.5行为学评价 21 d后采用敞箱实验评价各组行为学。在一80 cm×80 cm×40 cm四壁涂黑的正方形纸板箱底面画25 cm正方形，将大鼠放入箱底，安静状态下记录3 min内大鼠水平、垂直运动和修饰次数。然后进行糖水消耗实验，大鼠给予纯水和1%蔗糖水，记录24 h的消耗量。糖水偏爱度=1%蔗糖水量/总水量×100%。

1.6神经元检测 行为学测试完毕后，眼球取血处死动物。在 4℃迅速取脑，生理盐水清洗后，冰冻切片，选取海马组织切片，PBS洗涤3次，贴片，晾干，二甲苯脱脂，酒精脱水，焦油紫染色，水清洗，盐酸-酒精分色，酒精脱水后中性树胶封片。切片脱蜡脱水，蛋白酶K 消化，PBS 清洗，滴加 TUNEL试剂盒反应液和复合液，DAB 显色，苏木素复染并封片。显微镜下随意取 5个视野，观察海马神经元形态改变和海马区棕褐色凋亡细胞数。

1.7caspase-3蛋白分析 眼球取血处死动物后取脑组织，冻存管分装，液氮保存。解冻后研磨脑组织，加入预冷的蛋白裂解液，4℃条件下10 000 r/min 离心20 min，取上清，采用蛋白质定量试剂盒测定总蛋白。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离脑组织总蛋白，电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，PBS洗10 min。蛋白封闭后，GAPDH为内参，加入caspase-3 一抗和二抗，以1∶1 000耦联辣根过氧化物酶的羊抗兔IgG孵育30 min，暗室曝光、显影、晾干，凝胶图像处理软件分析光密度值。

1.8细胞因子检测 21 d处死实验动物，采集外周血，3 000 r/min离心15 min，分离血清后-80℃保存。采用ELISA法测定外周血TNF-α、IL-2和IL-8细胞因子水平，严格按照试剂说明书操作。

1.9统计学方法 采用SPSS19.0软件进行χ2、t检验。

2 结 果

2.1行为学评价 21 d后模型组、舒肝组和氟西汀组行为学指标明显低于对照组，而舒肝组和氟西汀组明显高于模型组(P<0.05)。舒肝组和氟西汀组行为学指标差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2海马神经元 对照组海马神经元细胞排列规则，细胞丰富，神经元胞膜完整，胞核形态正常；模型组海马神经元细胞排列不规则，细胞减少，细胞紊乱变稀，神经元胞膜破裂，细胞脱落形成空泡；舒肝组和氟西汀组海马神经元细胞排列较规则，细胞较丰富，神经元胞膜较完整，部分细胞萎缩、核变小，有部分空泡。见图1。

表1 各组行为学评价、海马神经元凋亡数和脑组织caspase-3蛋白表达及外周血细胞因子水平

与对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05

模型组、舒肝组和氟西汀组海马神经元凋亡数明显高于对照组，而舒肝组和氟西汀组低于模型组(P<0.05)，但舒肝组和氟西汀组海马神经元凋亡数差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

图1 各组海马神经元形态(×200)

2.3脑组织caspase-3蛋白表达 模型组、舒肝组和氟西汀组脑组织caspase-3蛋白表达明显高于对照组，舒肝组和氟西汀组明显低于模型组(P<0.05)，舒肝组和氟西汀组脑组织caspase-3蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.4外周血中细胞因子 模型组、舒肝组和氟西汀组外周血TNF-α、IL-2和IL-8水平明显高于对照组，舒肝组和氟西汀组显著低于模型组(P<0.05)。舒肝组和氟西汀组外周血TNF-α、IL-2和IL-8水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

3 讨 论

抑郁症发病机制复杂，可能与单胺类神经递质、甲肾上腺素、胆碱能-去甲肾上腺素等有关，大脑神经递质在神经突触间浓度减少，导致心理功能和精神活动低下，抑郁症海马神经细胞的凋亡相关，海马神经元凋亡是神经退行性病变的主要病理基础〔7〕。近年来发现抑郁症患者免疫活化产生细胞因子，外周血TNF-α、IL-2等细胞因子与抑郁症密切关系〔8〕。抑郁症属中医郁病范畴，郁病主要由七情所伤、情志不遂或郁怒伤肝、肝郁气滞而发病，病位在肝，因此，治郁之要，在于疏肝〔9，10〕。舒肝颗粒源于丹栀逍遥散，由当归、白芍等10味中药组成，具有疏肝解郁、清肝泻火、宁心安神之功，治疗郁病具有较好的临床疗效，但其作用机制尚不清楚〔11〕。本研究提示舒肝颗粒治疗抑郁症具有较好的疗效。舒肝颗粒可修复神经元细胞损伤，降低脑组织caspase-3蛋白表达，可能是由于舒肝颗粒方中柴胡和薄荷为君药，疏肝解郁，调达肝气；当归、白芍为臣药，养血敛阴，柔肝缓急；白术、干姜、甘草为佐药，和中补土，运化脾胃，生化营血；丹皮、桅子为使药，清宣郁热、解郁除烦。诸药配伍具有疏肝解郁、清肝泻火、宁心安神功效〔11，12〕。柴胡皂苷通过激活凋亡途径上游蛋白caspase-9，激活下游凋亡蛋白caspase-3，产生促进细胞凋亡作用〔13，14〕。栀子恢复海马的结构与功能，通过抗焦虑治疗抑郁症。本研究提示舒肝颗粒可降低外周血中细胞因子表达。这与柴胡疏肝解郁，柴胡皂苷可有效抑制海马区细胞形态和活性，减少海马区神经细胞凋亡，减少外周血TNF-α、IL-2和IL-8的产生有关〔15，16〕。

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