肝癌患者外周血淋巴细胞转录因子的表达及意义

戴 丹 胡东辉 张建军

(湖北省中山医院肝病科，湖北 武汉 430033)

在我国，由于乙型肝炎病毒(HBV)高发病率，肝癌是第二大最常见的恶性肿瘤〔1，2〕。目前对晚期肝癌的治疗选择有限，研发有效的肝癌治疗方法是非常有必要的。以树突细胞(DC)为基础免疫治疗肝癌患者的研究表明DC接种和免疫治疗可能是一个安全有效的肝癌治疗方案〔3〕。已知每个T细胞亚群的分化和功能由特定的转录因子(TF)调控，如Runx1和Runx3，这些TF在Th1与Th2激活或沉默细胞因子转录基因、γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素(IL)-4的过程中，Th直接与表达于T细胞的T-box(T-bet 和GATA3)相互作用〔4〕。与之相应的特异性TF分别为T-bet和GATA-3。研究表明Th1/Th2细胞平衡或失衡在一些生理病理过程中起重要作用〔1，2，5〕，检测这些细胞相对应的TF比值，即T-bet/GATA-3，会更客观反映Th1/Th2细胞分化〔3,6〕。因此，研究Th1/Th2细胞在其TF水平的平衡结果将更为显著。本研究中，我们采用荧光实时定量PCR(RT-qPCR)法检测肝癌患者和健康对照者外周血单个核细胞(PBMC)的Th1-、Th2-特异性TF(分别为T-bet，GATA-3)mRNA表达水平，以阐明Th1/Th2细胞失衡与肝癌间的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 湖北省中山医院2014年1月至2015年1月初次诊断为肝癌并需外科手术治疗的患者23例为肝癌组，体检中心健康者21例为对照组，均无自身免疫性疾病(如糖尿病，甲状腺功能亢进等)和免疫治疗等病史。肝癌组中有乙型肝炎病史者19例。与对照组相比，肝癌组谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、谷氨酰转肽酶(GGT)、总胆固醇(TC)均显著升高(P<0.05)。两组年龄、性别、汉族比例、体重指数(BMI)、碱性磷酸酶(ALP)等无差异(P>0.05)。见表1。

表1 两组研究对象一般临床特点

1.2方法 采集所有受试者的空腹外周静脉血标本，收集于真空血液收集管中，以乙二胺四乙酸(EDTA)为抗凝血剂，并于采样后4 h内完成样本处理。

1.3主要仪器和试剂 ABI 7500自动荧光定量PCR仪，ABI 9700 PCR仪和ABI 3900高通量DNA合成仪均购自Applied Biosystems Inc.(美国)。ELITE 200电泳设备和Dolphin-DO凝胶成像系统购自WEALTEC(美国)。RCO3000T-5-VBC CO2细胞培养孵化器购自KENDRO(美国)。CK40-32PH倒置显微镜购自奥林巴斯(东京，日本)。Trizol法RNA提取试剂盒购自TaKaRa(日本)。反转录缓冲液(5×)，PCR缓冲液，Taq酶购自达纳基因(中国广州)。人体淋巴细胞分离管购自达科为生物技术公司(中国深圳)。 RPMI1640细胞培养基购自Gibco(美国)。

1.4PCR引物的设计和合成 在GenBank搜索靶基因(T-bet，GATA-3)的mRNA序列，采用Primer Express2.0软件进行基因引物设计。引物序列：T-bet上游引物：5'-CGGCTGCATATCGTTGAGGT-3'，下游引物：5'-GTCCCCATTGGCATTCCTC-3'，扩增片段：107 bp；GATA-3上游引物：5'-TCATTA AGCCCAAGCGAAGG-3'，下游引物：5'-GTCCCCATTGGCATTCCTC-3'，扩增片段：107 bp；β-actin上游引物：5'-GCATGGGTCAGAAGGATTCCT-3'，下游引物：5'-TCGTCCCAGTTGGTGACG AT-3'，扩增片段：106 bp。

1.5细胞总RNA提取和实时PCR(RT-PCR) 用含有淋巴细胞分离液的淋巴细胞分离管分离外周静脉血淋巴细胞。调节淋巴细胞至(1～5)×106/ml，并在37℃、5%CO2培养箱中温育培养4～8 h，使细胞附着管壁。分离淋巴细胞，于离心机在12 000 r/min离心15 min，收集悬浮淋巴细胞。用Trizol试剂溶解沉淀细胞。根据试剂盒说明书从淋巴细胞中分离总RNA。4 μl模板RNA用于逆转录反应，在ABI 9700进行，条件：37℃保温1 h，95℃ 3 min。5 μl反转录cDNA模板用于PCR反应，采用ABI 7500自动荧光定量PCR仪。用无菌双蒸水用作阴性对照。PCR条件：93℃变性3 min，然后93℃ 30 s、55℃ 45 s和72℃ 45 s反应40个循环。PCR完成后，由计算机软件进行自动分析数据，计算靶基因和内参基因拷贝数。

1.6统计学方法 采用SPSS19.0软件进行t检验。

2 结 果

肝癌组PBMC T-bet mRNA水平显著低于对照组(P<0.01)，GATA-3 mRNA水平显著高于对照组(P=0.024)，T-bet mRNA/GATA-3 mRNA明显低于对照组(P=0.031)，见表1。

表1 两组T-bet、GATA-3 mRNA表达水平比较

3 讨 论

目前对晚期肝癌的治疗选择有限，研发有效的肝癌治疗方法是非常有必要的。既往研究表明，Th1/Th2比例失衡可能导致一些疾病的发生，如癌症、自身免疫性疾病、过敏性疾病、内分泌疾病、感染性疾病和器官移植排斥反应〔7,8〕。正常情况下，Th1细胞，Th2细胞与Th17细胞结合，最终形成CD4+T效应细胞调节网〔9〕。当幼稚CD4+T细胞受外部抗原的刺激，其根据不同细胞因子的作用而增殖和分化成多种CD4+T效应细胞。IL-12和IFN-γ诱导幼稚CD4+T细胞向Th1细胞分化。IL-12是决定CD4+T分化成Th1细胞的一个关键细胞因子，与其受体IL-12R的结合可诱导和激活信号转导因子和转录蛋白(STAT)4的活化，这可上调IFN-γ，并可激活STAT1和Th1细胞分化的特异TF-T-bet〔10〕。Th1细胞产生的IFN-γ可调节细胞免疫和抗移植物反应，并起到抗感染和抗肿瘤的重要作用。而IL-4可诱导活化的CD4+T细胞分化成Th2细胞。IL-4与其受体IL-4R结合，激活STAT6，也激活Th2细胞特异性的TF GATA-3〔11,12〕。Th2细胞分泌IL-4，IL-5和IL-13，这可调节体液免疫和过敏反应，并参与系统性自身免疫性疾病的发生。

Th2型细胞因子在恶性皮肤癌患者表达显著，而Th1型细胞因子则主要表达于良性皮肤癌患者〔13〕。此后，在许多恶性肿瘤中观察到Th2型细胞因子，包括非小细胞肺癌、绒毛膜癌和神经胶质瘤〔14，15〕。研究发现在肝癌外周血Th1/Th2细胞比例失衡，显示Th2型细胞因子优势表达，并有随临床分期及疾病恶化程度增加而增加的趋势，表明Th2型细胞因子的表达与原发性肝癌的进展有关〔16〕。 TF GATA-3的优势表达也发生于乳腺癌和胰腺癌〔17，18〕。本研究表明，肝癌患者PMBC T-bet的表达降低而GATA-3的表达增加，T-bet/GATA-3比值显著降低，且GATA-3表达显著，显示在转录水平存在Th2细胞漂移。Th2细胞漂移是癌细胞免疫逃逸的常见机制之一，且与癌症发生、发展、转移和再发生有关。因此，纠正Th1/Th2细胞失衡可能是癌症免疫疗法的一个重要途径。

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