老年骨质疏松与血浆Klotho蛋白、FGF23蛋白水平的相关性

李宝善 钟 淼 蒋 宜 唐渝平 裴文楠 李婷婷

(重庆市急救医疗中心老年科，重庆 400014)

Klotho基因是1997年由Kuro及其同事首次在小鼠中发现的一种抑制衰老相关表型的基因，并以古希腊神活中纺织生命之线女神的名字——Klotho来命名。研究发现Klotho基因突变与人类衰老的各种表型，包括寿命缩短、动脉硬化、肺气肿、骨质疏松(OP)等有密切关系〔1〕。早期研究发现Klotho 缺陷小鼠股骨、胫骨及椎骨骨皮质厚度较野生型小鼠显著减低，其骨代谢主要特点为：骨形成与骨吸收明显减低，骨形成减低程度超过骨吸收，其结果导致净骨量丢失，呈低骨转换状态，即类似于人类老年OP的骨代谢特征〔2〕。随后研究发现来源于Klotho缺陷(突变)小鼠的成骨细胞及破骨细胞在体外培养时，其成骨细胞增殖正常而其碱性磷酸酶活性减低、矿化的基质形成显著减少；而破骨细胞的吸收活性与成活率均正常，但其破骨细胞前体分化为破骨细胞过程则明显受到抑制〔3〕，即提示Klotho缺陷影响了小鼠骨代谢过程。Yamada等〔4〕、Zarrabeitia等〔5〕在研究不同人群Klotho基因单核苷酸多态性时发现，Klotho基因启动区 G-395A单核苷酸多态性与其骨密度有明确相关性。田小春等〔6〕在研究Klotho基因 G-395A 、F352V 与C370S单核苷酸多态性与老年人群原发性OP关系时，也发现Klotho基因 G-395A 单核苷酸多态性与汉族人群OP有明确相关性，且存在着性别差异性，这就说明Klotho基因与人类OP有明确相关性。而针对Klotho基因表达产物——Klotho蛋白水平变化与老年OP相关性研究尚未见报道。本研究分析血浆Klotho、FGF23蛋白水平与老年OP的相关性及可能信号通路。

1 对象和方法

1.1研究对象 2013 年5月至2015年5月重庆市急救医疗中心住院老年OP患者 92例为研究组，男 28 例，女64例，年龄60～99岁，均采用双能X线检查法测定骨密度(BMD)，根据世界卫生组织(WHO)1994 年推荐的OP标准诊断。均未服用性激素、糖皮质激素或任何影响钙磷代谢的药物，排除患有甲状腺疾病、Cushing 综合征、严重全身慢性疾病。对照组为同期住院病人经双能X线检查排除OP老年患者92例，男49例，女43例，年龄60～93岁。两组性别、年龄无显著差异。本研究方案通过重庆市急救医疗中心医学伦理委员会审查，均签署知情同意书。

1.2诊断标准 血脂异常诊断符合《中国成人血脂异常防治指南》(2007)〔7〕；高血压诊断参考《中国高血压防治指南2010》〔8〕；2型糖尿病诊断符合1999年世界卫生组织2型糖尿病诊断标准。

1.3BMD及生化指标测定 应用双能X线骨密度仪(美国GE 公司)，检测部位为第2、3腰椎(L2～L3)，股骨颈和股骨大粗隆，如，有1个或以上部位T值(所测BMD与正常同性别、同部位峰值骨量的差)≤-2.5s诊断为OP。测定结果由美国GE 公司配置的软件进行分析。患者入院次日清晨测量身高、体重，并计算体质指数(BMI)。抽取空腹静脉血6 ml，其中3 ml肝素抗凝，湘仪L400台式低速自动平衡离心机(中国湖南湘仪离心机厂生产)2 500 r/min离心10 min分离血浆，-20℃冰箱保存备用；余3 ml乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，2 500 r/min离心10 min分离血清，使用日立7060全自动生化分析仪测定总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、血糖。取血浆样品100 μl，应用人Klotho、FGF23蛋白酶联免疫吸附(ELISA)检测试剂盒(DY5334-05、DY2604-05、DY008，购自美国R&D公司)，使用SpectraMax M2e 酶标仪，按试剂盒说明书流程操作。

1.4统计学处理 应用PASW18.0统计分析软件，组间比较进行χ2检验、t检验和Logistic 多因素回归分析。

2 结 果

2.1两组一般临床情况对比 研究组女性患者比例明显高于对照组，同时血浆Klotho蛋白、FGF23蛋白水平明显低于对照组(P<0.05)。而两组年龄、BMI、血脂异常、高血压和糖尿病患者无统计学差异(P>0.05)。见表1。

表1 两组一般临床情况对比

2.2低血浆Klotho蛋白水平是老年OP独立危险因素 以中位数为分界线，低于中位数视为血浆Klotho、FGF23降低，赋值为1，否则赋值为0；患有血脂异常、高血压、糖尿病者赋值为1，否则赋值为0。Logistic多因素回归分析提示血浆Klotho蛋白水平、女性是老年OP的独立危险因素。见表2。

表2 OP危险因素的多因素回归分析

3 讨 论

OP是一种以骨量低下、骨微结构破坏、导致骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身性骨病。OP分为原发性和继发性两大类。原发性OP又分为绝经后OP(Ⅰ型)、老年性OP(Ⅱ型)和特发性OP(包括青少年型)3种。而临床中最多见的是绝经后OP及老年性OP。OP导致的髋骨、桡骨远端及脊柱压缩性骨折发生率也明显增加，而老年OP所致骨折常出现延迟愈合或不愈合，因而严重影响老年人生活质量、导致社会家庭负担增加。OP发病过程中不仅受到来自其自身内环境与生活外环境的影响，也受到其本身遗传基因及其表达状态的调控。前期研究〔9〕中应用携带小鼠Klotho基因的腺相关病毒载体作用于去势制备的OP(类似于绝经后OP)模型大鼠，发现Klotho表达上调明显减缓OP病情进展和改善OP骨微结构的破坏程度。推测Klotho在原发性OP发生、发展中所起的作用有可能就是通过Klotho蛋白的生物活性来影响骨代谢而发挥其生物学作用的。膜型Klotho蛋白作为FGF23的一种特有的受体辅助因子，通过形成Klotho-FGF23-FGF受体1复合物形式影响FGF23的信号转导而发挥其调节血磷、维生素D3稳态及骨矿化等作用〔10〕。学者〔11〕也发现在合并有2型糖尿病的OP患者中，血清FGF23明显下降，提示FGF23与OP有关。由此推测Klotho蛋白可能就是通过FGF23通路调节骨代谢，影响OP的发生、发展。而其具体信号通路、调节机制还有待究。

本研究也证实了老年女性是OP高发人群，及时、有效干预女性高危人群极其重要。本研究提示低FGF23水平并非OP独立危险因素，与国外学者研究结果一致〔12〕。

1Kuro-o M，Matsumura Y，Aizawa H，etal.Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing〔J〕.Nature，1997；390(6655)：45-51.

2Kawaguchi H，Manabe N，Miyaura C，etal.Independent impairment of osteoblast and osteoclast differentiation in klotho mouse exhibiting low-turnover osteopenia〔J〕.J Clin Invest，1999；104(3)：229-37.

3Kawaguchi H，Manabe N，Chikuda H，etal.Cellular and molecular mechanism of low-turnover osteopenia in the klotho-deficient mouse〔J〕.Cell Mol Life Sci，2000；57(5)：731-7.

4Yamada Y，Ando F，Niino N，etal.Association of polymorphisms of the androgen receptor and klotho genes with bone mineral density in Japanese women〔J〕.J Mol Med，2005；83(1)：50-7.

5Zarrabeitia MT，Hernández JL，Valero C，etal.Klotho gene polymorphism and male bone mass〔J〕.Calcif Tissue Int，2007；80(1)：10-4.

6田小春，马厚勋，刘晓林，等.重庆老年汉族人群klotho G-395A、F352V与C370S基因多态性与原发性骨质疏松症的相关性研究〔J〕.重庆医科大学学报，2010；35(12)：1769-72.

7中国成人血脂异常防治指南制订联合委员会.中国成人血脂异常防治指南〔J〕.中华心血管病杂志，2007；35(5)：390-419.

8中国高血压防治指南修订委员会.中国高血压防治指南2010〔J〕.中华心血管病杂志，2011;39(7)：579-616.

9王艳娇，马厚勋，李宝善，等.腺相关病毒介导的klotho基因表达对去势大鼠骨Runx2及MMP-13表达的影响〔J〕.基础医学与临床，2012；32(5)：487-92.

10Yamazaki M，Ozono K，Okada T，etal.Both FGF23 and extracellular phosphate activate Raf/ MEK/ERK pathway via FGF receptors in HEK293 cells〔J〕.J Cell Biochem，2010；111(5)：1210-21.

11Reyes-Garcia R，Garcia-Martín A，García-Fontana B，etal.FGF23 in type 2 diabetic patients：relationship with bone metabolism and vascular disease〔J〕.Diabetes Care，2014；37(5)：e89-90.

12Desjardins L，Liabeuf S，Renard C，etal.FGF23 is independently associated with vascular calcification but not bone mineral density in patients at various CKD stages〔J〕.Osteopor Int，2012；23(7)：2017-25.