响应面法优化马齿苋黄酮超声波提取工艺

王 波， 张晓艳， 黄 攀， 吕德雅， 严 帆， 刘 辉

(安徽师范大学环境科学与工程学院，安徽 芜湖 241002)

马齿苋(PortulaceoleraceaL.)是马齿苋科马齿苋属一年生肉质草本植物，又名蚂蚁菜、长命菜、瓜子菜、五行草等，在中国南北方均有分布，资源十分丰富[1-3]。马齿苋含有黄酮、多糖、多酚、生物碱等多种生物活性物质，具有广泛的药理活性及营养保健功能[4-7]，是中国卫生部划定的101种药食同源野生植物之一，曾经被列入2008年北京奥运会的菜谱[8-9]，对马齿苋功能性成分的研究越来越受到人们的关注。黄酮类化合物具有较低的毒性和广谱的药学功能，具有抗肿瘤、抗过敏、抗菌、抗病毒、抗衰老、降低心肌耗氧量、降血糖及增强机体免疫力等功能[10-11]。近年来，对于马齿苋黄酮的研究，主要涉及提取工艺[12-14]、抑菌和抗氧化性等方面[15-17]，但目前未见利用响应面分析法优化马齿苋黄酮提取工艺方面的报道。响应面分析法通过建立数学模型解决受多种因素影响的最优组合问题，用于确定各因素及其交互作用在工艺过程中对响应值的影响，常用于原料功效成分提取工艺条件的优化[18-21]。超声波提取技术具有快速、廉价和高效的特点，广泛应用于多种天然产物的提取[22]。本研究采用超声波法提取马齿苋黄酮，并应用响应面法优化其提取工艺，为马齿苋植物资源的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 马齿苋样品

马齿苋样品2015年10月15日采于安徽省安庆市潜山县。新鲜马齿苋先用自来水冲洗掉泥沙，然后用蒸馏水冲洗干净，最后用滤纸迅速吸干表面附着水分，于90 ℃条件下杀青30 min，60 ℃下烘干至恒质量。烘干后的马齿苋样品用粉碎机粉碎，过60目尼龙筛，分别存于自封袋中编号备用。

1.2 仪器与试剂

主要仪器：752型紫外可见分光光度计(上海佑科仪器仪表有限公司产品),KH3200E型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司产品),SHZ-D(Ш)型循环水式真空泵(上海凌科实业发展有限公司产品)。

主要试剂：芦丁标准品,亚硝酸钠,硝酸铝,氢氧化钠,无水乙醇，以上试剂均为分析纯。

1.3 马齿苋黄酮超声波提取工艺

准确称取已过60目筛的马齿苋干燥样品1.000 0 g，进行超声波提取，然后过滤，最后将滤液定容至50 ml，即得马齿苋黄酮提取液。

1.4 马齿苋黄酮提取率的测定

精确称取芦丁标准品0.008 0 g，加60%乙醇溶解，转移至50 ml容量瓶中并稀释至刻度，摇匀，即得芦丁标准溶液[21]。分别移取上述芦丁标准溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 ml至10只10 ml容量瓶中，加入60%乙醇溶液补充至5.0 ml。先分别加入5%NaNO2溶液0.3 ml摇匀,放置6 min后，分别加入10% Al(NO3)3溶液0.3 ml摇匀,放置6 min后，再分别加入1.0 mol/L NaOH溶液4.0 ml，用蒸馏水定容至10.0 ml摇匀,放置15 min后，在510 nm处测定吸光度值[23]。以吸光度值为纵坐标，黄酮质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到芦丁标准曲线的回归方程是Y=18.419 0x+0.012 6，相关系数R2=0.999 3。精密移取马齿苋黄酮提取液1.5 ml至10 ml容量瓶中，同上操作加入5%NaNO2、10% Al(NO3)3和1.0 mol/L NaOH，定容，在510 nm处测定吸光度。根据测得的吸光度和标准曲线回归方程计算马齿苋中黄酮的含量，然后计算马齿苋黄酮提取率，马齿苋黄酮提取率=(马齿苋黄酮质量/马齿苋质量) ×100%。

1.5 马齿苋黄酮提取的单因素试验

前人研究结果表明，在黄酮的超声波辅助提取过程中，黄酮提取率受乙醇体积分数、液料比、提取时间和提取温度等提取工艺参数的影响[20,24]。因此，分别以这4个工艺参数为单因素进行试验，研究其对马齿苋黄酮提取率的影响，各因素水平见表1。

1.6 马齿苋黄酮提取的响应面试验

在单因素试验结果基础上，采用4因素3水平对乙醇体积分数、液料比、提取时间和提取温度进行优化试验，同时采用Design-Expert.V8.0.6.1进行响应面分析，确定超声波法提取马齿苋黄酮的最优工艺。试验因素和水平设计见表1。

表1马齿苋黄酮提取的响应面试验因素与水平表

Table1FactorsandcodedlevelsofresponsesurfaceanalysisforextractingflavonoidfromPortulaceoleraceaL.

水平乙醇体积分数(%)液料比(ml/g)提取时间(min)提取温度(℃)-16010∶1405007020∶1606018030∶18070

1.7 统计分析

试验设3次重复，采用SPSS 17.0 for Windows 软件进行数据分析，采用origin86软件作图。

2 结果与分析

2.1 马齿苋黄酮提取的单因素试验结果

2.1.1 乙醇体积分数对马齿苋黄酮提取率的影响 控制反应条件为液料比 30∶1(ml/g)，反应温度50 ℃，提取时间60 min，考察乙醇体积分数分别为50%、60%、70%、80%、90%、100%时的黄酮提取率。由图1可知，黄酮提取率随乙醇体积分数的增大呈先上升后下降的趋势。当乙醇体积分数为70%时，黄酮提取率达到最大值(1.16%)。再增大乙醇体积分数，黄酮提取率反而下降。这可能是由于随着乙醇体积分数的增大黄酮类化合物的溶解度也随之增大，当乙醇体积分数过大时样品中的其他醇溶性物质被浸出，与黄酮形成竞争[20]，从而导致黄酮提取率降低。因此确定最佳乙醇体积分数为70%。

图1 乙醇体积分数对黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on flavonoid extraction yield

2.1.2 液料比对马齿苋黄酮提取率的影响 控制反应条件为乙醇体积分数70%，反应温度50 ℃，提取时间60 min，考察液料比分别为 5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 (ml/g)时的黄酮提取率。由图2可知，黄酮提取率随液料比的增大呈先上升后下降的趋势。当液料比为 20∶1时，黄酮提取率达到最大值(1.36%)。如果溶剂用量少，则黄酮溶出量少；如果溶剂用量过大，杂质溶出量也增加，且成本增加[22]。因此确定最佳液料比为 20∶1。

图2 液料比对黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of ratio of liquid-to-solid on flavonoid extraction yield

2.1.3 提取时间对马齿苋黄酮提取率的影响 控制反应条件为液料比 30∶1(ml/g)，乙醇体积分数70%，反应温度50 ℃，考察超声波提取时间分别为20 min、40 min、60 min、 80 min、100 min及120 min时的黄酮提取率。由图3可知，黄酮提取率随提取时间的增大呈先上升后下降的趋势。当提取时间为60 min时，黄酮提取率达到最大值(1.44%)。提取时间较短时黄酮没有完全溶出，当时间延长时溶出的黄酮可能被氧化分解掉，使得提取率下降。因此，确定最佳提取时间为60 min。

图3 提取时间对黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on flavonoid extraction yield

2.1.4 提取温度对马齿苋黄酮提取率的影响 控制反应条件为液料比 30∶1(ml/g)，乙醇体积分数70%，提取时间60 min，考察反应温度分别为30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃ 时的黄酮提取率。由图4可知，黄酮提取率随提取温度的增大呈先上升后下降的趋势。当提取温度为60 ℃时，黄酮提取率达到最大值(1.44%)。这种变化主要是由于温度在一定范围内升高时，物质的溶解度会增加，分子间的黏滞度下降，使得更多的黄酮得以溶出。但过高的温度会破坏黄酮的分子结构，从而降低黄酮的提取率[25]。因此，确定最佳提取温度为60 ℃。

图4 提取温度对黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on flavonoid extraction yield

2.2 马齿苋黄酮提取的响应面试验结果

2.2.1 回归模型的建立和方差分析 采用Design-Expert V8.0.6.1软件，根据Box-Behnken试验设计，以乙醇体积分数(A)、液料比(B)、提取时间(C)、提取温度(D)4因素作为自变量，以马齿苋黄酮提取率作为响应值，共设计29个试验点，其中24个分析点，5个零点[26-28]。试验设计方案及数据处理结果见表2，方差分析结果见表3。对表2结果进行统计分析，建立四元二次响应面回归方程(编码方程)：黄酮提取率=1.300 0-0.009 2A+0.130 0B+0.013 0C+0.013 0D+0.042 0AB-0.020 0AC-0.020 0AD+0.050 0BC-0.043 0BD+0.040 0CD-0.000 3A2-0.057 0B2-0.059 0C2-0.046 0D2。

表2Box-Behnken设计方案及响应值

Table2Box-Behnkenexperimentaldesignandcorrespondingresults

试验号因素水平乙醇体积分数(A)液料比(B)提取时间(C)提取温度(D)黄酮提取率(%)11-1001.052-1-1001.20300001.37401011.305-11001.326100-11.3070-1100.97800001.319-100-11.20100-10-10.991101101.41120-1-101.1113-10-101.1814010-11.301511001.3416-10101.331710-101.171800-1-11.251900111.192000-111.102100001.2522-10011.302300001.312401-101.352500001.262610101.2427001-11.182810011.32290-1011.16

表3响应面二次回归方程各项与黄酮提取率的方差分析

Table3Analysisofvarianceforeachtermoftheresponsesurfacequadraticregressionequationandtheextractionrateofflavonoid

项目平方和自由度均方差F值P值模型0.280140.0204.500.0040**A0.00110.0010.220.6429B0.20010.20044.18<0.0001**C0.00210.0020.480.4993D0.00210.0020.440.5178AB0.00710.0071.610.2253AC0.00210.0020.360.5601AD0.00210.0020.360.5601BC0.01010.0102.200.1597BD0.00810.0081.690.2152CD0.00610.0061.430.2524A20.00010.00000.9913B20.02110.0214.680.0483*C20.02310.0235.010.0419*D20.01410.0143.030.1037残差0.063140.004失拟项0.054100.0052.330.2150纯误差0.00940.002总离差0.35028

A:乙醇体积分数；B：液料比；C：提取时间；D：提取温度。*、**分别表示该项目对黄酮提取率的影响显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)，R2=0.818 2。

响应面二次模型方差分析结果(表3)显示：失拟项不显著(P=0.215 0>0.05)，说明模型的拟合程度良好，残差均由随机误差引起，未知因素对试验结果干扰很小[29]；模型的P值为0.004 0，表明该二次方程模型为极显著[30]；四元二次响应面回归方程的决定系数R2=0.818 2，说明回归方程拟合性好。综上所述，该二次响应面回归方程的失拟项很小，模型极显著，试验误差小，说明模型拟合非常可靠，因此可用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析[31]。

根据模型拟合结果，马齿苋黄酮最佳提取工艺参数为乙醇体积分数80%、液料比 30∶1 (ml/g)、提取时间55.40 min、提取温度64.19 ℃，此条件下马齿苋黄酮提取率为1.42%。为方便操作，将马齿苋黄酮最佳提取工艺参数修正为乙醇体积分数80%、液料比30∶1(ml/g)、提取时间55 min、提取温度64 ℃。在此最佳提取工艺条件下进行验证试验，3次重复，结果表明马齿苋黄酮的提取率为1.38%，接近模型预测的马齿苋黄酮提取率，说明预测值与试验值之间具有较好的拟合性，从而也证明了响应面分析法优化马齿苋黄酮提取工艺的可行性。

2.2.2 马齿苋黄酮提取的响应面分析 由乙醇体积分数、液料比、提取时间和提取温度对马齿苋黄酮提取率所构成的响应图，可反映两因素交互作用对黄酮提取率的影响。固定2个因素在0水平上，分析乙醇体积分数、液料比、提取时间和提取温度交互作用对马齿苋黄酮提取率的影响。根据回归分析结果，采用Design-Expert.V8.0.6.1软件作出响应曲面图(图5)。响应曲面图中，曲线走势越陡，影响越显著；曲线走势越平滑，影响越小[32]。由图5可知：液料比对马齿苋黄酮提取率的影响最为显著，表现为曲线较陡，其次为提取时间和提取温度，影响最不显著的是乙醇体积分数，表现为曲线较为平滑，随乙醇体积分数的变化，马齿苋黄酮提取率的变化较小。

图5 各因素间交互作用对黄酮提取率的响应面图Fig.5 Response surface plots for the effects of cross-interactions among different factors on the extraction rate of flavonoid

3 结 论

在单因素试验的基础上，利用试验设计软件Design-Expert，对自变量乙醇体积分数、液料比、提取时间和提取温度4因素与因变量黄酮提取率的数学模型进行了回归分析，得到的数学模型拟合性好，表明该模型准确可靠，能够用该模型代替试验真实点对试验结果进行预测，预测马齿苋黄酮的最佳提取条件及其理论最大提取率。根据数学模型预测出的试验条件和实际操作的可行性，确定马齿苋黄酮最佳提取工艺参数为：乙醇体积分数80%、液料比30∶1(ml/g)、提取时间55 min、提取温度64 ℃，此条件下马齿苋黄酮提取率为1.38%，与预测值1.42%相差较小。

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