乳酸对粪肠球菌的抑菌作用及作用机制

王凤婷， 靳盼盼， 刘 芳， 孙芝兰， 吴海虹， 王道营， 许晓曦， 徐为民

(1.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京 210014； 2.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

食品的安全、质量及营养价值是人们密切关注的问题[1]。食品在收获、加工、运输、储藏过程中容易变质[2]，产生有害物质或滋生新的致病菌[3]危害人体健康。肠球菌存在于人或动物消化道内，特定条件下会成为病原体引发感染性疾病[4]，人感染会引起泌尿系统感染、心内膜炎、伤口感染等，动物感染会引发脑炎、关节炎等[5]。粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)为肠球菌属革兰氏阳性菌，属于消化道内正常菌群，但污染食品后会引发疾病发生，作为食源性致病菌已在生的猪肉、鸡肉、牛肉及其他动物源食品中检出[6-7]。由于抗生素的大量使用，粪肠球菌已经对其产生耐药性，因此在临床治疗中有一定难度[8]。吴悠[9]等使用齐墩果酸和二甲基亚砜有效抑制了粪肠球菌的生长，Tong等[10]研究了多西环素、枸橼酸和去污剂组成的混合物(MTAD)与乳酸链球菌素(Nisin)复配对粪肠球菌的抑菌机理。

在肉类和家禽加工厂中使用最普遍的消毒剂即为有机酸[11]，乳酸作为三大有机酸之一[12]，能够参与人体正常的代谢[13]，在达到杀菌目的的同时不对人体产生危害。乳酸具有很强的防腐保鲜功能，可作为食品添加剂用于果酒、饮料、肉类、食品等的加工中，具有调节pH、抑菌、调味、保持色泽等作用[14]。乳酸并非食物[15]，广泛存在于发酵类食品中[16]，如酸奶、干酪、泡菜等。国内外有很多关于乳酸菌及其细菌类产物抑菌特性及机理的报道[17-18]，但关于乳酸抑菌效果及机理的研究较少。本研究拟以一株从肉制品中分离得到的粪肠球菌为试验菌株，研究乳酸对其的杀菌作用及机理，以期为今后以乳酸为基础杀菌剂和保鲜剂的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

所用菌株为粪肠球菌(EnterococcusfaecalisR612-Z1)，由江苏省农业科学院农产品加工研究所保存。试验用的脑心浸液肉汤(BHI)培养基购自北京陆桥生物公司。乳酸购自天津科密欧生物技术公司，荧光探针羧基荧光素双乙酸酯[5(6)-cFDA]和3,3-Dipropylthiadicarbocyanine iodide[DiSC3(5)]均购自Sigma公司，碘化丙啶(PI)购自生工生物工程公司，腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)检测试剂盒购自碧云天公司。

1.2 仪器与设备

所用仪器和设备主要有Accuri C6流式细胞仪(BD公司产品)，PE(Ultra View VOX)转盘式激光共聚焦显微镜(铂金埃尔默公司产品)，EVO-LS10扫描电子显微镜(蔡司公司产品)和BioPhotometer plus核酸蛋白测定仪(Eppendorf公司产品)。

1.3 方法

1.3.1 菌株培养 将冻存管中的粪肠球菌R612-Z1接种于新鲜的BHI培养基中，37 ℃、200 r/min培养，待生长至对数期时再次转接于新鲜培养基中，重复3次，备用。

1.3.2 细菌活性试验 按培养基体积1.00%接种活化后的粪肠球菌R612-Z1菌液于BHI液体培养基中，37 ℃摇床培养到OD600值为1.0时，取20 ml菌液分别置于不同的离心管中，4 ℃下6 000g离心10 min，收集菌体沉淀，然后在各管中分别加入相同体积的乳酸溶液，其浓度分别为0.25%、0.50%、1.00%。将菌悬液放入摇床中，分别在0 min、10 min、30 min、60 min、120 min、180 min取样，使用0.1 mol/L PBS缓冲液按照10倍递增稀释法[19]稀释样品至相应浓度，取100 μl均匀涂布于BHI固体平板上，37 ℃培养24 h，记录菌数。

1.3.3 扫描电镜 按培养基体积1.0%接种活化后的粪肠球菌R612-Z1菌液于BHI液体培养基中，在37 ℃摇床中培养至对数期，4 ℃下6 000g离心10 min，收集菌体沉淀，用0.01 mol/L PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤，去掉上清，加入同体积且质量浓度为1.0%的乳酸，以只加入相同体积PBS缓冲液为对照。37 ℃处理2 h，4 ℃下6 000g离心10 min，收集菌体沉淀，再用PBS缓冲液洗涤3次，除净上清，4 ℃下用2.5%的戊二醛固定12 h[20]。在扫描电子显微镜下观察菌体表面形态的变化。

1.3.4 细胞膜渗透性试验

1.3.4.1 激光共聚焦显微镜检测 使用羧基荧光素双乙酸酯[5(6)-cFDA]和碘化丙啶(PI)来区分活细胞与死细胞[21]。取对数期的菌液在4 ℃下6 000g离心10 min，收集菌体沉淀，用0.85%NaCl溶液洗涤菌泥后，其中一份加入同体积质量浓度为1.00%的乳酸，另一份加入同体积生理盐水的菌悬液作为对照，室温下处理2 h，每15 min振荡1次。收集菌泥重新悬浮在500 μl的生理盐水中，加入荧光探针cFDA(终浓度为100 μmol/L)，避光保存10 min，然后加入PI(终浓度为30 μmol/L)，避光反应10 min。混合液离心后用500 μl生理盐水悬浮菌泥，取3 μl菌液到载玻片上，加上盖玻片，置于激光扫描共聚焦显微镜下观察并拍照。

1.3.4.2 胞外ATP及紫外吸收物质的检测 取对数期的菌液在4 ℃下6 000g离心10 min，收集菌泥，使用0.01 mol/L PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤3次，将菌泥悬浮在质量浓度为1%的乳酸溶液中，25 ℃下处理，分别在0 min、10 min、30 min、60 min、120 min、180 min取样。将样品于4 ℃、10 000g下离心1 min，取上清测定其胞外小分子ATP浓度和紫外吸收物质(主要为核酸和蛋白质等)浓度的变化。按照ATP测定试剂盒说明书测定样品中ATP的含量，先测出ATP浓度与荧光值的标准曲线，然后在样品中加入ATP检测试剂，混合均匀后通过测定其化学发光值来确定ATP的浓度[22]。紫外吸收物质的浓度以紫外分光光度计测定的OD260值来表示。

1.3.5 流式细胞仪 使用方法1.3.4.1中处理好的菌液，依次用cFDA和PI染色[23]，于4 ℃下6 000g离心10 min，收集菌体，除去多余的荧光探针后，重悬于0.01 mol/L PBS缓冲液中。在检测过程中以低速率(1 s 400～600个)收集50 000个细胞，分别在525 nm和620 nm处检测样品绿色荧光和红色荧光，然后转化为数字信号。通过分析每个区域细胞的百分比来确定粪肠球菌的损伤程度。

1.3.6 细胞电势能的测定 使用荧光探针3,3-Dipropylthiadicarbocyanine iodide[DiSC3(5)]来测定粪肠球菌膜电位的变化。将活化好的菌液按培养基体积的1%接种于脑心浸液肉汤(BHI)液体培养基中，在37 ℃、200 r/min摇床中培养至对数期，于4 ℃下6 000g离心10 min，收集菌泥。使用5.0 mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)与5.0 mmol/L葡萄糖配置的缓冲液(缓冲液A)洗涤菌泥2次[24]，然后将菌泥重悬于缓冲液A中，加入终浓度为0.5 μmol/L的荧光探针DiSC3(5)，室温放置15 min，加入终浓度为100.0 mmol/L的KCl溶液，平衡K+浓度后，在样品中加入乳酸，每个样品取200 μl加入黑色的NBS板中，使用酶标仪检测其荧光强度变化(激发波长为622 nm，发射波长为670 nm)。

2 结果与分析

2.1 不同浓度的乳酸对粪肠球菌R612-Z1的杀菌效果

不同浓度的乳酸对粪肠球菌R612-Z1的杀菌效果如图1显示，样品的初始菌数约为 1×108，质量分数为1.00%的乳酸在10 min内全部杀死细菌，0.25%和0.50%的乳酸全部杀死细菌分别需要60 min和30 min。在最初检测点(0 min)，与对照相比，加入乳酸的样品的菌数均有减少，这是由于样品中添加乳酸后从混匀到取样需要一定时间，同时也说明乳酸对粪肠球菌的杀菌作用明显，并且杀菌迅速。

粪肠球菌菌数的对数值小于等于1.4时，菌数不可检测；未加入乳酸的样品为对照。图1 不同浓度的乳酸对粪肠球菌R612-Z1的杀菌效果Fig.1 The antibacterial effect of lactic acid(LA) on Enterococcus faecalis R612-Z1 at different concentrations

2.2 乳酸对粪肠球菌R612-Z1细胞形态结构的影响

图2显示，未经乳酸处理的对照组细胞完整，表面光滑，呈规则的球形，细胞间隙明显。经过质量浓度为1.00%的乳酸处理1 h后，细胞外膜溶解，部分细胞壁缺失，菌体连成片，细胞严重变形，呈不规则球形，胞外能明显看到有内容物漏出。乳酸处理对粪肠球菌R612-Z1的细胞壁和细胞质膜造成破坏[25]，导致内容物漏出。

2.3 乳酸对粪肠球菌R612-Z1细胞膜渗透性的影响

2.3.1 转盘式激光共聚焦结果 细菌细胞通过核酸荧光探针5(6)-cFDA和核酸荧光探针PI进行染色，根据染色结果(图3)可以直观地看出细胞膜通透性的变化情况。5(6)-cFDA是一种疏水性复合物[21]，能进入具有完整细胞膜结构的细胞，在非特异性脂酶水解作用下生成羧基荧光素(cF)，呈绿色荧光。PI仅能进入受损细胞，与DNA或RNA结合后呈现红色荧光，PI进入胞内后，cFDA发出的荧光变弱[26]。因此，未受损的细胞呈绿色，破损的细胞呈红色。未经乳酸处理的样品(图3A)主要为绿色荧光，经过质量浓度为1.00%的乳酸处理后几乎所有细胞表现为红色荧光(图3B)，有少量的细胞损伤较轻，呈黄色，说明乳酸处理后粪肠球菌R612-Z1细胞膜的通透性增加了。

A：未经乳酸处理的对照组细胞；B：经过质量浓度为1.00%的乳酸处理1 h后的细胞。图2 乳酸处理粪肠球菌的扫描电镜观察Fig.2 SEM images of LA-treated E. faecalis cells

A：未经乳酸处理的对照组细胞；B：经过质量浓度为1.00%乳酸处理1 h后的细胞。图3 乳酸处理粪肠球菌后的激光共聚焦结果Fig.3 CLSM images of LA-treated E. faecalis cells

2.3.2 胞外ATP及紫外吸收物质 使用试剂盒中提供的ATP标准品确定ATP浓度与荧光值的定量关系(Y=222 856.00x+784.01，R2=0.999)，然后通过测定样品荧光值来确定样品中ATP的浓度。图4显示，0 min时，对照组样品的ATP浓度为7.28 nmol/ml，检测期间浓度变化不大，质量浓度为1.00%乳酸处理样品的ATP浓度为126.72 nmol/ml，在随后测定的3 h内，ATP浓度基本维持稳定。通过测定紫外吸收物质的浓度来确定乳酸对细胞膜通透性的影响，260 nm处主要为DNA、RNA、代谢产物、离子等物质的吸收峰[27]。图5显示，0 min时，对照组样品吸光度为0.25，3 h内保持稳定，乳酸处理组吸光度为1.03，其后吸光度保持在 0.90～1.00，说明乳酸处理后，细胞膜通透性增强，胞内ATP及核酸物质泄漏。由于加入乳酸后从混匀到取样需要一定时间，因此在0 min测得吸光度值较高，由此也可以说明，质量分数为1.00%的乳酸作用迅速，瞬间对细胞膜造成破坏。

未经乳酸处理的样品为对照。图4 胞外ATP浓度的变化Fig.4 Changes of concentrations of extracellular ATP

2.3.3 流式细胞仪检测结果 通过荧光探针cFDA和PI双染[28]对细胞的完整性进行验证，cFDA可以进入所有细胞，而PI仅能进入膜损伤的细胞且与核酸亲和力更强，可代替已进入细胞内的cFDA分子。流式细胞仪分析后，可按细菌细胞的损伤状态将其分为完整细胞、受损细胞、死亡细胞和未染色细胞。细菌样品处理后，利用流式细胞仪获得粪肠球菌流式点状图，首先以对照组样品为基准划分象限，象限Q1-LR为cFDA染色的完整活细胞，象限Q1-UR为双重染色的受损活细胞，象限Q1-UL为PI染色的死亡细胞，象限Q1-LL为未染色细胞。图6显示，粪肠球菌R612-Z1经过1.00%乳酸处理后细胞的分布与对照样品有明显差异，未经乳酸处理的细菌样品中99.7%为活细胞，经过乳酸处理后的细菌样品中93.8%为死细胞，5.2%为受损细胞。Booyens[23]根据流式细胞仪的结果，分析大蒜精油处理3种双歧杆菌前后其细胞膜的损伤程度。对照组样品和处理组样品中分别存在0.2%和1.0%未染色细胞，Silva[29]也指出流式数据中存在未能染色的细胞，对这种细胞存在的原因有2种猜测[23]。第一，有一部分细胞膜在处理过程中经历严重的破坏，导致其核酸流出，而2种荧光探针均是对核酸进行染色，Wang[25]也指出乳酸能够破坏细胞质膜及胞内物质结构。第二，细胞聚集成团或成链，降低了染色率。综上所述，粪肠球菌R612-Z1经过1.00%乳酸处理后大部分细菌死亡，少部分受损，与激光共聚焦的结果相呼应，说明乳酸对粪肠球菌具有严重的破坏作用，可对其细胞膜造成损伤。

未经乳酸处理的样品为对照。图5 紫外吸收物质吸光度变化Fig.5 Changes of absorbance of UV-absorbing materials

A：未经乳酸处理的细菌样品；B：经过乳酸处理后的细菌样品。Q1-LR：cFDA染色的完整活细胞；Q1-UR：双重染色的受损活细胞；Q1-UL：PI染色的死亡细胞；Q1-LL：未染色细胞。图6 乳酸处理后的粪肠球菌流式点状图Fig.6 Flow cytometry dot plots of LA-treated E. faecalis cells

2.4 乳酸对粪肠球菌R612-Z1细胞膜电势能的影响

通过测定细胞膜电势能变化，进一步研究乳酸对粪肠球菌的作用。荧光探针DiSC3(5)是一种对膜电势变化敏感的阳离子荧光染料[30]，能够在完整的极化细胞膜中累积并且自行淬灭，乳酸处理后细胞膜去极化[31]，导致与细菌细胞结合的荧光探针脱落进入溶液中，荧光值增加。对样品在670 nm处的荧光进行检测(图7)，尼日利亚菌素和缬氨霉素分别作为阴性对照和阳性对照，加入KCl平衡细胞内外K+浓度后测定荧光值为13 000左右，对照组样品荧光值在测定期间保持稳定，加入尼日利亚菌素后略有下降，加入K+载体缬氨霉素后荧光值迅速上升，处理1 min时荧光值为28 159，加入1.00%乳酸处理后的样品的荧光值在1 min内变化较快，之后趋于稳定，但荧光值低于阳性对照样品的荧光值。荧光值的迅速上升说明乳酸对粪肠球菌作用迅速，细胞膜快速去极化对其功能造成破坏。

未经乳酸处理的样品为对照。图7 乳酸处理后粪肠球菌膜电势变化Fig.7 Change of membrane potential of LA-treated E. faecalis cells

3 结 论

乳酸杀菌迅速，加入乳酸后菌数迅速下降，浓度为0.25%、0.50%、1.00%的乳酸分别在60 min、30 min、10 min内达到完全杀菌的效果，乳酸作用于粪肠球菌R612-Z1后使其胞内ATP及核酸类物质快速释放到胞外。Sun等[32]的研究结果表明，单独使用乳酸链球菌素(Nisin)和乳酸杆菌表层分离蛋白SlpB或者2种物质复配使用后也会使胞外ATP和核酸物质增加，ATP浓度在反应1.5 h时达到最高，260 nm处的吸光值在反应6.0 h时达到最大，说明复配物对细菌作用缓慢。乳酸处理粪肠球菌后，细胞形状无明显变化，但有胞内物质流出。乳酸对于细菌的破坏主要是破坏其膜通透性，对细胞整体形态无明显影响[33-34]。使用肉桂醛作为抑菌剂处理大肠杆菌和金黄色葡萄球菌时，胞外核酸、蛋白质等物质含量增多，电导率增大，细胞膜电势变化[35]。因此，细胞膜通透性的变化是多种抑菌物质达到抑菌或杀菌作用的原因。通过研究发现，乳酸处理迅速改变了细胞膜内外电势，增加了细胞膜通透性，导致内容物流出，从而起到了抑菌作用，但乳酸导致细胞膜分子结构阶段损伤的作用机制仍需要深入研究。

质量浓度为1.00%的乳酸处理细菌1 h后，通过扫描电镜观察到细胞外部被内容物包裹，同时胞外ATP浓度及紫外吸收物质浓度的增加也说明胞内有物质渗漏。通过cFDA和PI染色，在激光共焦显微镜与流式细胞仪下观察，乳酸处理后大部分细胞死亡，红色荧光明显增强，表明细胞膜通透性增强，导致荧光探针PI进入胞内。因此，乳酸作用于粪肠球菌时会快速破坏其细胞壁及细胞膜结构，使其细胞膜通透性增强，胞内的内容物如ATP、核酸等快速渗出，达到杀菌效果。

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