山奈酚通过调控AMPK/Nrf2/HO-1信号通路缓解ox-LDL介导的内皮细胞损伤

康桂兰 景增秀

(西宁市第二人民医院，西宁 810003)

血管内皮细胞是维持血管壁正常结构和功能的重要屏障，内皮损伤是动脉粥样硬化(Atheroscle-rosis，AS)的始动环节[1]。有文献报道，氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipopro-tein，ox-LDL)是早期AS发生和发展的重要因素，在AS病灶部位中存在明显增加的氧化的低密度脂蛋白[2,3]。因此减少ox-LDL对内皮细胞的氧化损伤是预防和治疗AS的有效途径。黄酮类化合物是天然抗氧化剂，能够缓解脂蛋白的过氧化作用，进而有效地防治AS的发生[4]。山萘酚(Kaempferol)是一种黄酮醇类化合物，广泛存在于水果、蔬菜、豆类、茶叶中，具有抗癌、抗炎、抗氧化等多种生理作用[5,6]。已有研究表明，山奈酚能够抵抗缺血再灌注等心血管疾病损伤[7,8]，抵抗AS[9]，但是具体的分子机制并不明确。本研究在体外通过用ox-LDL诱导人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)损伤，进一步探讨山奈酚对ox-LDL诱导的细胞增殖、凋亡、炎性因子和黏附分子产生和氧化应激的影响，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 HUVECs购自ATCC；山奈酚购自Sigma公司；MTT试剂盒、annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒购自南京凯基生物有限公司；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)试剂盒购于南京建成生物工程研究所；核提取试剂盒购于Pierce 公司；RIPA 细胞裂解液、PMSF和BCA 蛋白含量测定试剂购自上海碧云天生物技术研究所；Anti-cleaved-caspase-3、anti-Bcl-2、anti-TNF-α、anti-IL-1β、anti-IL-6、anti-VCAM1、anti-ICAM1、anti-E-selectin、anti-p-AMPK、anti-Nrf2、anti-HO-1和anti-GAPDH等 I 抗购自Abcam公司和Santa Cruz 公司；Ⅱ抗购自北京中杉金桥生物有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养及药物处理 将HUVECs置于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃、5% CO2的培养箱中培养。当细胞生长至80%～90%融合时，用0.25%的胰酶进行消化传代，分别接种到不同规格的培养板中。药物处理：先用山奈酚预处理HUVECs 2 h,再用100 μg/ml的ox-LDL处理24 h。

1.2.2siRNA转染 根据Lipofectamine 2000转染试剂说明书，分别将Nrf2和HO-1的siRNA转染到HUVECs。转染6 h后，更换新的培养基。转染24 h后，山奈酚处理2 h,再用100 μg/ml的ox-LDL处理24 h。

1.2.3实验分组 将细胞分为6组：对照(control)组，正常培养；ox-LDL组，100 μg/ml的ox-LDL处理24 h；Kaempferol+ox-LDL组，50 μmol/L的山奈酚处理2 h后再用100 μg/ml的ox-LDL处理24 h；Kaempferol+ox-LDL+compound C组，5 mmol/L的compound C处理2 h，然后50 μmol/L的山奈酚处理2 h，再用100 μg/ml的ox-LDL处理24 h；Kaempfe-rol+ox-LDL+si-Nrf2组，si-Nrf2转染24 h，然后50 μmol/L的山奈酚处理2 h，再用100 μg/ml的ox-LDL处理24 h；Kaempferol+ox-LDL+si-HO-1组，si-HO-1转染24 h，然后50 μmol/L的山奈酚处理2 h，再用100 μg/ml的ox-LDL处理24 h。

1.2.4MTT检测细胞活力 将细胞接种到96孔板上，每组设置4个复孔，分别进行不同处理。然后每孔加入10 μl MTT试剂(0.5 mg/ml)，在培养箱中孵育4 h后弃去培养基，每孔加入150 μl二甲基亚砜溶液，震荡溶解15 min,在酶标仪490 nm处检测吸光度(A)。

1.2.5流式细胞术检测细胞凋亡 将细胞接种到6孔板上，每组设置4个复孔，分别进行不同处理。然后经胰酶(不含EDTA)消化，PBS洗涤、离心后，弃上清液。每孔加入500 μl 结合缓冲液重悬细胞，然后加入10 μl annexin V-FITC，5 μl PI，避光室温孵育15 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.6ROS含量的测定 将细胞接种到6孔板上，每组设置4个复孔，分别进行不同处理。然后每孔加入10 μmol/L DCFH-DA避光孵育30 min，流式细胞术分析胞间ROS水平。

1.2.7SOD含量测定 根据试剂盒说明书进行SOD含量测定。

1.2.8蛋白提取 将细胞接种到24孔板上，每组设置4个复孔，分别进行不同处理。每孔加入RIPA裂解液与PMSF的混合液(100∶1)裂解细胞15 min，离心收集上清提取总蛋白。根据试剂盒说明书提取核蛋白。BCA 蛋白试剂盒进行蛋白定量。

1.2.9Western blot检测蛋白水平 取适量样品蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，采用半干转方法将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，然后用5%脱脂奶粉室温封闭1 h。加入Ⅰ抗4℃过夜孵育，之后加入Ⅱ抗室温孵育1 h。用Odyssey红外激光成像系统进行扫描。

2 结果

2.1山奈酚提高ox-LDL诱导的内皮细胞活性 山奈酚的化学结构如图1A所示。MTT试剂盒检测细胞活力，结果如图1B所示。与对照组相比，ox-LDL处理显著降低了HUVECs的细胞活性。当加入不同浓度山奈酚预处理后，细胞活力呈山奈酚浓度依赖性提高。当山奈酚浓度大于30 μmol/L时，细胞活力显著上升。

2.2山奈酚降低ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡 流式细胞术检测细胞凋亡，结果如图2A和2B所示。与对照组相比，ox-LDL处理显著提高了细胞的凋亡水平。与ox-LDL处理组相比，山奈酚预处理能够呈浓度依赖性降低细胞凋亡，当浓度大于10 μmol/L时，差异具有显著统计学意义。我们进一步通过Western blot检测凋亡相关蛋白的表达，结果如图2C、D。与对照组相比，ox-LDL组的cleaved-caspase-3的蛋白水平显著上调，而Bcl-2的水平显著降低。山奈酚预处理呈浓度依赖性下调ox-LDL诱导的cleaved-caspase-3的蛋白水平，上调Bcl-2的表达。后续实验选择50 μmol/L作为山奈酚的处理浓度。

2.3山奈酚下调ox-LDL诱导的炎性因子表达 Western blot检测TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白表达，结果如图3所示。与对照组相比，ox-LDL处理显著上调TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白水平。与ox-LDL组相比，山奈酚预处理能够显著下调ox-LDL诱导的TNF-α、IL-1β和IL-6表达。

图1 山奈酚对ox-LDL诱导的HUVECs细胞活力的影响Fig.1 Effects of kaempferol on cell viability in ox-LDL-treated HUVECsNote: vs control group;#.P<0.05 vs ox-LDL group.

图2 山奈酚对ox-LDL诱导的HUVECs细胞凋亡的影响Fig.2 Effects of kaempferol on cell apoptosis in ox-LDL-treated HUVECsNote: vs control group;#.P<0.05 vs ox-LDL group.

图3 山奈酚对ox-LDL诱导的HUVECs中TNF-α、IL-1β和IL-6表达的影响Fig.3 Effects of kaempferol on expression of TNF-α,IL-1β and IL-6 in ox-LDL-treated HUVECsNote: vs control group;#.P<0.05 vs ox-LDL group.

图4 山奈酚对ox-LDL诱导的HUVECs中VCAM1、ICAM1和E-selectin表达的影响Fig.4 Effects of kaempferol on expression of VCAM1,ICAM1 and E-selectin in ox-LDL-treated HUVECsNote: vs control group;#.P<0.05 vs ox-LDLgroup.

2.4山奈酚下调ox-LDL诱导的黏附分子表达 Western blot检测血管细胞黏附分子(VCAM1)、细胞间黏附分子(ICAM1)和选择素E(E-selectin)的蛋白表达，结果如图4所示。与对照组相比，VCAM1、ICAM1和E-selectin的蛋白表达水平在ox-LDL组中显著上调，而山奈酚预处理能够显著下调VCAM1、ICAM1和E-selectin的表达。

2.5山奈酚抑制ox-LDL诱导的氧化应激 如图5所示，与对照组相比，ox-LDL处理能够显著上调ROS的产生，下调SOD的活性。与ox-LDL组相比，山奈酚预处理能够显著下调ox-LDL诱导的ROS产生，上调SOD 的活性。

2.6山奈酚通过激活AMPK-Nrf2-HO-1通路抑制氧化应激损伤 Western blot检测p-AMPK、AMPK、Nrf2和HO-1的蛋白表达，结果如图6A～C所示。与对照组相比，p-AMPK、Nrf2和HO-1在ox-LDL组中的蛋白水平显著下降，而山奈酚预处理显著提高p-AMPK、Nrf2和HO-1的蛋白水平。为了进一步确定AMPK-Nrf2-HO-1通路与山奈酚的保护作用紧密相关，我们用AMPK抑制剂compound C、si-Nrf2和si-HO-1进行处理来抑制该通路蛋白的表达。如图6A～C所示，与kaempfe-rol+ox-LDL组相比，C.C+kaempferol+ox-LDL组中p-AMPK、Nrf2和HO-1的蛋白水平均显著下调，si-Nrf2+kaempferol+ox-LDL组中Nrf2和HO-1的蛋白水平显著下调，p-AMPK表达无显著变化，而si-HO-1+kaempferol+ox-LDL组中HO-1的蛋白水平显著下调，p-AMPK和Nrf2表达无显著变化。这个结果说明AMPK通过调控Nrf2影响HO-1的表达。与kaempferol+ox-LDL组相比，Compound C、si-Nrf2和si-HO-1处理组都能够增加ROS的生成(图6D)。进一步通过MTT实验和流式细胞术检测发现，与kaempferol+ox-LDL组相比，Compound C、si-Nrf2和si-HO-1处理组的细胞活力显著下降，而细胞凋亡显著增加(图6E和6F)。这些结果说明山奈酚能够通过激活AMPK-Nrf2-HO-1通路降低ox-LDL诱导的氧化应激等损伤。

图5 Effects of kaempferol on oxidative stress in ox-LDL-treated HUVECsFig.5 山奈酚对ox-LDL诱导的HUVECs中氧化应激的影响Note: vs control group;#.P<0.05 vs ox-LDL group.

图6 山奈酚对ox-LDL诱导的HUVECs中AMPK-Nrf2-HO-1通路的影响Fig.6 Effects of kaempferol on AMPK-Nrf2-HO-1 signaling in ox-LDL-treated HUVECsNote: vs control group;#.P<0.05 vs ox-LDL group;△.P<0.05 vs kaempferol+ox-LDL group.

3 讨论

AS是一种常见的心血管疾病，可由高血压、高血糖、高血脂、吸烟、饮酒等多种因素引发，严重威胁人类健康。血管内皮损伤是AS的主要病理基础，是一个包括凋亡、炎症和氧化应激的复杂过程。本研究发现山奈酚能够缓解ox-LDL诱导的HUVECs损伤，并初步探讨了其分子机制，发现山奈酚能够通过激活AMPK/Nrf2/HO-1信号通路降低氧化应激反应，从而减少内皮损伤。

在正常生理状态下，内皮细胞的增殖和凋亡保持动态平衡，以此来维持血管的正常功能。研究表明，在AS斑块中存在广泛的内皮细胞凋亡，而内皮细胞的过度凋亡是内皮功能障碍的始动环节。在本研究中，我们首先通过MTT实验检测细胞活力，发现ox-LDL处理显著降低了HUVECs的细胞活力。当用山奈酚预处理后，HUVECs的细胞活力呈浓度依赖性提高，说明山奈酚能够缓解ox-LDL诱导的细胞活力损伤。流式细胞术检测细胞凋亡，发现ox-LDL处理显著提高HUVECs的凋亡率，而山奈酚能够呈浓度依赖性降低ox-LDL诱导的细胞凋亡。我们进一步通过Western blot检测了凋亡相关蛋白的表达，发现山奈酚能够呈浓度依赖性下调ox-LDL诱导的cleaved-caspase-3的蛋白水平，上调Bcl-2的表达。以上结果说明山奈酚能够保护HUVECs抵抗ox-LDL诱导的损伤，且保护作用呈浓度依赖性。

血管内皮的炎性反应在AS的发生发展过程中发挥重要的作用，白细胞向血管内皮的滚动、黏附、迁移和积聚，是血管内皮炎性反应的标志[10]。内皮细胞在外界环境刺激下，能够诱导多种炎性因子和黏附分子的产生，加速白细胞向内皮细胞的黏附和炎性反应。Jiang等[11]研究显示，ox-LDL处理HUVECs后，IL-6、TNF-α、VCAM1、ICAM1和E-selectin的含量明显升高。有文献指出，山奈酚能够通过降低炎性因子和黏附因子的表达发挥抗AS作用[12,13]。我们的研究结果与以上结果一致，ox-LDL处理显著上调了TNF-α、IL-1β、IL-6、VCAM1、ICAM1和E-selectin的表达，而山奈酚预处理使以上蛋白的表达显著下调。以上结果说明山奈酚能够保护HUVECs抵抗ox-LDL诱导的炎性损伤。

有文献报道，细胞增殖凋亡异常以及炎性反应与氧化应激有密不可分的关系。当ROS的生物活性高于抗氧化防御能力时，即产生氧化应激反应。在多种心血管疾病中，例如AS代谢综合征、血脂异常，ROS水平明显升高，与疾病的发生发展紧密相关[14，15]。SOD是主要的抗氧化酶，能够保护机体免受氧化损伤[16]。本研究结果发现，ox-LDL处理能够显著上调ROS的产生，下调SOD的表达。山奈酚预处理后能够显著下调ox-LDL诱导的ROS产生，上调SOD 的表达，与Xiao等[8]的研究结果一致。这个结果说明山奈酚能够保护HUVECs抵抗ox-LDL诱导的氧化应激损伤。

Nrf2 是一个调控多种抗氧化酶基因表达的重要的转录因子，例如HO-1[17,18]，一种具有抗氧化和细胞保护作用的酶[19,20]。Nrf2/HO-1 信号的激活能够保护细胞免受氧化损伤。AMPK是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，有研究报道AMPK的活化能够抑制异常炎症反应和氧化应激[21]。本实验的Western blot检测发现，ox-LDL处理显著下降p-AMPK、Nrf2和HO-1的蛋白水平，而山奈酚预处理显著提高了p-AMPK、Nrf2和HO-1的蛋白水平。山奈酚能够通过提高Nrf2的表达来降低ROS的产生[22],AMPK在癌症中起到调控作用[23]，为了进一步确定AMPK-Nrf2-HO-1通路与山奈酚的保护作用紧密相关，我们用AMPK抑制剂compound C、si-Nrf2和si-HO-1进行处理来抑制该通路蛋白的表达。与kaempferol+ox-LDL组相比，Compound C、si-Nrf2和si-HO-1处理组都能够提高ROS的生成。进一步通过MTT实验和流式细胞术检测发现，与kaempferol+ox-LDL组相比，Compound C、si-Nrf2和si-HO-1处理组的细胞活力显著下降，而细胞凋亡显著增加。这些结果说明山奈酚能够通过激活AMPK-Nrf2-HO-1通路降低ox-LDL诱导的氧化应激等损伤。

综上所述，山奈酚抑制ox-LDL诱导的HUVECs活力降低，减少细胞凋亡，下调炎性因子和黏附分子的表达，缓解氧化应激反应，这与AMPK-Nrf2-HO-1信号通路的激活有关。本研究进一步阐明了内皮损伤及AS的发病机理，为山奈酚防治AS提供了理论依据。

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