酿酒高粱籽粒微观形态分析及其果皮厚度和单宁含量的相关性

闫松显，袁 河，雷元春，赵 亮，罗汝叶，倪德让，王 莉*

（1.贵州茅台酒股份有限公司，贵州 仁怀 564501；2.茅台集团博士后科研工作站，贵州 仁怀 564501）

高粱（Sorghum bicolor（L.）Moench）是我国第五位禾本科栽培作物，可以作为粮食、饲料或者酿造原料来使用，具有耐贫瘠、抗逆性好的特点。近年来随着农业生产条件的改善和新品种的推广应用，高粱的品质指标及专用化水平均得到了极大地提升[1]。酿酒高粱作为中国白酒酿造的主要原料，需求量也越来越大[2]。

高粱颖果果皮由外果皮、中果皮和内果皮三层构成。外果皮在发育过程中细胞排列紧实，一般不含淀粉粒；中果皮细胞则排列松散，且不规则，有的品种该果皮层含有淀粉粒；内果皮层主要由管细胞与横细胞构成。种皮层位于果皮层内侧，与糊粉层紧密相连[3]，该层组织由两部分组成：有色种皮层（有的高粱品种没有该层）和无色种皮层[4-5]，且有色种皮层往往较厚。

果皮和种皮厚度是高粱籽粒加工制粉的一个重要参数，果皮薄的籽粒人工去皮较难，适合于机械加工[4]。不同高粱品种果皮厚度差异较大，从8～160μm不等[4]，其中中果皮层对果皮厚度的影响较大。高粱籽粒单宁主要存在于果皮和种皮中，果皮厚度、种子颜色和种皮的有无是影响单宁含量的重要因素[5-6]。研究表明单宁含量和果皮层厚度具有较强的相关关系（R＞0.64）[7]，果皮厚度＞60μm的高粱品种材料的单宁含量较高[7]。因此果皮和种皮越厚，种子颜色越红，籽粒的单宁含量就越高。

胚乳中的淀粉粒根据成熟过程中物理状态的不同可分为角质淀粉粒和粉质淀粉粒两种。角质淀粉粒也称玻璃质淀粉粒，是指种子在成熟脱水过程中高聚合态蛋白质仅仅依附在淀粉粒周围形成的一种致密状结构，此时的淀粉粒形态极不规则；粉质淀粉粒的间隙则较大，淀粉粒总体上呈椭圆状形态。早期研究根据胚乳中角质淀粉占比的多少制定了明确的角质率（玻璃质率）分级[8]。谷物籽粒淀粉粒体积和表面积均呈多峰分布的特点，且个体差异较大[9]。不同的胚乳质地（直链淀粉和支链淀粉含量，角质淀粉与粉质淀粉的比例）是影响高粱籽粒加工和凝胶特性的重要因素[10]。

目前我国高粱绝大部分用于白酒酿造[11]，高粱品质的优劣直接决定了酒体的质量[12-13]。随着酿酒行业的深度调整，酒企对高粱原料的品质和专用化水平要求越来越高。关于高粱籽粒性状的报道有很多[3-5]，但主要集中在对淀粉粒的特性及颖果发育过程的分析，而酿酒高粱果皮和淀粉粒径及其与品质性状间关系的研究则较少。酿酒高粱籽粒微观形态差异分析是研究其品质特点的一个重要途径，该研究通过对全国已推广主要酿酒高粱品种的果皮和淀粉粒径长度进行分析，初步总结单宁含量和果皮厚度（果皮层和种皮层）间的关系，以期为后续酿酒高粱品质指标研究以及酒企酿造原料标准的建立提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本实验共采用19份在全国已推广种植的高粱品种（主要为酿酒高粱）进行研究：红缨子（糯性）、红珍珠（糯性）、黔高7号（黔7：糯性）、黔高8号（黔8：糯性）、泸州红1号（泸州1：糯性）、国窖红1号（国窖1：糯性）、晋杂22号（晋22：粳性）、晋杂23号（晋23：半糯性）、晋杂35号（晋35：粳性）、晋杂103号（晋103：粳性）、晋杂104号（晋104：粳性）、晋糯3号（晋3：糯性）、晋糯202号（晋202：糯性）、两糯一号（两糯一：糯性）、辽粘3号（辽3：糯性）、辽杂15号（辽15：粳性）、辽杂18号（辽18：粳性）、辽杂19号（辽19：粳性）和辽杂37号（辽37：粳性）。另有一个澳洲粳高粱材料（澳洲粳）和一个西南糯高粱材料（西南糯）作为对照。

戊二醛、磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）、锇酸、二甲基甲酰胺、柠檬酸铁铵溶液、氨溶液：国药集团化学试剂有限公司；单宁酸（均为分析纯）：德国默克公司。

1.2 仪器与设备

JSM-6390LV扫描电镜：日本JEOL公司；Cary 6000i分光光度计：安捷伦科技（中国）有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 田间种植

所有材料于2016年4月中旬在温室进行漂盘育苗，2016年5月初移栽至仁怀市有机高粱基地试验田，采用随机区组实验，每个材料设置3次重复，每个重复为一行，其中行长3 m，行距50 cm，株距30 cm。待高粱材料开花后进行套袋隔离，2016年8月中旬后按材料成熟先后分别收获，种子脱粒并自然晒干后留存备用。

1.3.2 检测方法

扫描电镜：高粱籽粒用液氮冷冻后破碎，用2.5%的戊二醛4℃固定，0.2 mol/L PBS冲洗3次，每次10 min。再用1%锇酸4℃固定2 h，PBS冲洗3次，每次10 min。分别用体积分数为30%、50%、70%、90%、100%的乙醇溶液脱水，每个浓度批次10 min；其中体积分数100%乙醇脱水再重复一次。样品在临界点干燥后喷金并用扫描电镜在15 kV电压下进行拍照观察。每个高粱样品采用不同籽粒进行扫描电镜分析，重复3次。

单宁含量测定采用国标GB/T 15686—2008《高粱单宁含量的测定方法》，每个高粱样品重复进行3次单宁含量测定，最后计算平均含量。

高粱果皮、种皮厚度以及胚乳中淀粉粒的长度和宽度用卡尺进行测量。文中高粱籽粒的果皮厚度统指籽粒的果皮和种皮厚度之和。

1.3.3 数据分析

果皮厚度及淀粉粒长度差异的非参数Kruskal-Wallis检验、Wilcoxon Rank Sum检验、Behrens-Fisher检验和单宁含量与种皮厚度间的简单线性回归分析都在R软件中进行分析。

2 结果与分析

不同酿酒高粱品种在植株高矮、胚乳质地及品质性状等方面具有较大的差异[14-15]，为了说明高粱籽粒胚乳微观形态与品质性状间的相关关系，实验检测了高粱籽粒胚乳中角质淀粉粒、粉质淀粉粒及种皮厚度等微观结构，结果见图1。由图1可知，高粱籽粒胚乳中角质淀粉粒（图1A）排列紧密，形态极不规则；而粉质淀粉粒呈卵圆形（图1B），排列松散。果皮层的外、中、内三层清晰可见（图1C和图1D），种皮层则紧邻糊粉层（糊粉粒呈圆锥状结构）。

图1 高粱籽粒胚乳淀粉粒形态及果皮厚度Fig.1 Morphology of sorghum endosperm starch grains and pericarp thickness

不同酿酒高粱的果皮厚度、角质淀粉粒径长、粉质淀粉粒径长及单宁含量等指标的检测结果见表1。

表1 不同酿酒高粱4个指标检测结果Table 1 Determination results of four indicators of different liquor-making sorghums

2.1 果皮厚度

2.1.1 红缨子高粱果皮厚度

以红缨子高粱品种为例将酿酒高粱果皮厚度值的分布进行一个简单说明，结果见图2。

由图2A可知，红缨子高粱果皮厚度的分布并不集中，其中＞100μm的统计值尤为突出（图2A右图），这与EARP CF等[4]的研究结果相一致。频数分布图（图2A左图）表明，红缨子高粱的果皮厚度也不是单峰分布。由于本实验中酿酒高粱品种果皮厚度统计值主要集中在100μm以内，因此该研究只针对＜100μm的果皮厚度进行统计和分析，而果皮厚度＞100μm的则另行进行分析和研究。红缨子高粱的果皮厚度＜100μm频率分布见图2B。由图2B可知，红缨子果皮厚度分布的概率密度曲线（图2B左图中细线）与标准正态分布曲线（图2B左图中粗线）基本吻合，说明果皮厚度在该区间的分布比较集中，呈中间多、两头少特点，统计异常值也较少（图2B右图）。红缨子高粱的果皮厚度平均为（59.74±9.87）μm。

图2 红缨子高粱果皮厚度分布频数(A)及概率密度(B)Fig.2 Distribution frequency(A)and probability density(B)of pericarp thickness of Hongyingzisorghums

2.1.2 酿酒高粱的果皮厚度差异显著性分析

酿酒高粱品种中两糯一的果皮厚度值最大（见表1）为83.69μm，而辽15的果皮厚度较小，为26.69μm。所有品种（材料）果皮厚度箱线图如图3所示，其中箱型宽度代表了样本容量，箱型越宽表示样本容量越大。

图3 不同高粱品种果皮厚度对比Fig.3 Comparison of pericarp thickness of different sorghums varieties

由图3可知，红缨子、红珍珠、西南糯和国窖1等品种材料的果皮厚度分布比较集中，并且种皮厚度处于中偏厚水平，而一些粳高粱品种如晋202、辽15、辽18和澳洲粳的种皮厚度则较低。

非参数Kruskal-Wallis检验结果表明，不同高粱品种（材料）果皮厚度差异极显著（P＜0.01）。两两比较Wilcoxon Rank Sum检验结果表明西南糯高粱群体（红缨子、红珍珠、黔8、泸州1等）分别与晋糯系列品种和东北地区的辽杂系列品种差异显著（P＜0.05）。其中遵义地区推广面积最大的红缨子高粱品种与晋23、晋202、两糯一、辽3、辽15、辽18、辽19、辽37和澳洲粳等高粱品种材料的果皮厚度差异都显著（P＜0.05）。而两糯一、晋202和辽15与其他大部分品种材料的果皮厚度差异也显著（P＜0.05）。

红缨子高粱品种的果皮（果皮层和种皮层）厚度分布不是呈单峰分布特点，但在＜100μm的范围糯高粱品种材料的果皮厚度则比较接近，且比粳高粱品种材料果皮厚。实际生产上西南糯高粱籽粒常呈红色，种皮层较厚，该地区粒用高粱主要作为酱香型白酒酿造原料来使用，在七个轮次制酒生产中表现出耐蒸煮和耐翻糙等特点，究其原因，籽粒具有较厚的果皮层和较小的体积。

红缨子、红珍珠、黔8等西南区推广面积较大的高粱品种与晋糯系列品种和辽杂系列品种果皮厚度差异较大，其中红缨子还分别与其他多个高粱品种果皮厚度差异明显。该结果再次验证了西南区糯高粱品种材料是一个独特的种质群体，该种质群体具有籽小色红、果皮厚、环境适应性广等特点这一结论[1]。两糯一高粱品种的果皮厚度值最大，晋202和辽15等高粱品种的果皮厚度值则较小，推广面积较大的红缨子、国窖1、晋22、辽杂系列高粱的果皮厚度则居中，说明就酿酒原料生产而言，并不仅要考虑单一品质性状的突出，往往还要综合考虑其他性状表现。

2.2 角质和粉质淀粉粒径

图4 粉质淀粉和角质淀粉粒径对比Fig.4 Comparison of grain diameter between corneous starch and floury starch

由图4可知，高粱籽粒胚乳中角质淀粉粒径长度平均为17.61μm，粉质淀粉粒径长度平均为15.51μm，二者差异极显著（P＜0.01）。为了便于对比分析，采用淀粉粒径长度这一指标来对酿酒高粱胚乳角质淀粉粒和粉质淀粉粒进行比较，数据均值如表1所示。

不同高粱品种（材料）角质淀粉粒和粉质淀粉粒径长度箱线见图5，箱型宽度代表了样本容量，箱型越宽表示样本容量越大。

图5 不同高粱品种角质(A)及粉质(B)淀粉粒径对比Fig.5 Comparison of corneous(A)and floury(B)starch grain diameter among different liquor-making sorghums

由图5A可知，辽15、晋22和澳洲粳等高粱品种材料的角质淀粉粒径值较大，西南糯高粱品种材料（红缨子、黔8、泸州1）的角质淀粉粒径值适中，而晋23、晋35等晋杂系列高粱品种的角质淀粉粒径值则较低。由图5B可知，红珍珠、澳洲粳、辽15等高粱品种材料的粉质淀粉粒径值较大，而晋103、辽37等高粱品种的粉质淀粉粒径值则较低。

为了控制统计检验时的Ⅰ型错误率，实验采用Behrens-Fisher检验来对高粱品种材料角质淀粉粒和粉质淀粉粒径长度进行两两差异比较。结果表明，晋35与红缨子、两糯一、黔8和西南糯等西南区糯高粱品种材料的角质淀粉粒径长度差异显著（P＜0.05），红珍珠与澳洲粳、晋22等粳高粱品种的角质淀粉粒径长度差异显著（P＜0.05）。红珍珠同时还与国窖1、晋103、晋104、晋202、晋22、晋35、辽15、辽18、辽19、辽37、黔7、西南糯等高粱品种材料的粉质淀粉粒径长度差异显著（P＜0.05），辽37则分别与澳洲粳、国窖1、红珍珠、晋104、晋22、晋3、辽15、辽18、辽19、黔7、西南糯等高粱品种材料的粉质淀粉粒径长度差异显著（P＜0.05）。

该研究中高粱角质淀粉和粉质淀粉粒径长度的分布区间分别是13.82～20.05μm和10.50～20.00μm，这与申瑞玲等[10]和田晓红等[16]的研究结果相一致。胚乳中淀粉粒径长度差异较大，同一籽粒不同发育时期淀粉粒径差异也较大，并且胚乳中靠近“淀粉发生中心”的淀粉粒径较长，而远离“淀粉发生中心”的淀粉粒径则较短[3]；角质淀粉和粉质淀粉是胚乳质地的两种结构，受遗传和环境等因素的共同决定[17]，这是导致不同高粱品种两种淀粉粒径长差异的主要原因。辽15、晋22等粳高粱品种的角质淀粉粒径长度较长，而西南区糯高粱品种红缨子、黔8和泸州1的角质淀粉粒径长度则适中。北方粳高粱品种晋35与西南糯高粱品种材料的角质淀粉粒径长度差异显著（P＜0.05），红珍珠高粱品种与晋杂系列品种和辽杂系列品种的粉质淀粉粒径差异都显著（P＜0.05），因此推测不同酿酒工艺对高粱原料的淀粉粒形态要求也是不同的（北方高粱原料主要用于清香和浓香型白酒的酿造，西南区糯高粱原料主要用于酱香型白酒的酿造）[11，18]。

2.3 单宁含量与果皮厚度的关系

为了说明高粱籽粒单宁含量与果皮厚度及淀粉粒径长度间的关系，分别对单宁含量与果皮厚度、单宁含量与角质淀粉粒径长度和单宁含量与粉质淀粉粒径长度进行简单线性回归分析。结果表明，只有单宁含量与果皮厚度间具有较好的直线相关关系（R=0.501 4），回归方程及回归线见图6。由图6可知，所有样点围绕回归线两侧分布，说明该回归结果可靠，基本上能够说明酿酒高粱籽粒单宁含量与果皮厚度（果皮层和种皮层）间的正相关关系，果皮厚度每增加1μm，籽粒的单宁含量则增高0.014 7%。

图6 酿酒高粱籽粒单宁含量与果皮厚度的线性相关性Fig.6 Linear correlation between tannin content and the pericarp thickness of liquor-making sorghums

西南区糯高粱品种由于长期的自然驯化和人工选择[1]，具有较高的单宁含量。北方的粳高粱品种材料籽粒体积较大，种皮颜色也不一致，单宁含量则较低。不同酿酒工艺对原料的单宁含量要求都不一致，酱香型白酒高粱原料比浓香型和清香型白酒高粱原料单宁含量都要高，其他的一些品质指标要求也不同。酿造原料的品质是白酒风味和质量的重要保证，原料产地与名优酒企区位分布具有很高的契合度，因此怎样结合当地原料特点来服务酿酒产业，是我国专用粮发展的一个重要导向。

3 结论

本实验对全国主要的酿酒高粱品种籽粒的微观结构（果皮层和种皮层厚度、角质淀粉粒径长度、粉质淀粉粒径长度）进行了分析，并分别说明其与酿造性状单宁含量间的相关性。不同酿酒高粱的果皮厚度、淀粉粒径长度差异都比较明显。以红缨子为代表的西南区糯高粱的单宁含量相对较高，不同质地淀粉粒径长度与其他地区酿酒高粱区分比较明显，这些性状表现是酱香型白酒红粮原料的重要品质特点。

酿酒高粱的果皮层和种皮层厚度与单宁含量具有较好的相关性，籽粒的微观形态是其品质性状的重要反映。通过籽粒微观形态差异分析可以研究不同地区酿酒原料的品质特点，也能为酒企原料标准的建立和细化提供一定的理论依据和参考。

参考文献：

[1]闫松显，吕云怀，王 莉，等.西南区酿酒高粱的种质形成和发展[J].中国酿造，2017，36（5）：17-21.

[2]WANG L,WANGY Y,WANG D Q,et al.Dynamic changes in the bacterial community in Moutai liquor fermentation process characterized by deep sequencing[J].J Inst Brewing,2015,121(4)：603-608.

[3]李栋梁，荆彦平，李小刚，等.高粱胚乳细胞与母体组织发育关系的研究[J].中国农业科学，2014，47（17）：3336-3347.

[4]EARPCF,MCDONOUGH CM,AWIKA J,et al.Testa development in thecaryopsisof Sorghum bicolor(L.)Moench[J].J Cereal Sci,2004,39(2)：303-311.

[5]VARGAS-SOLÓRZANOJW,CARVALHOCWP,TAKEITICY,et al.Physicochemical propertiesof expanded extrudatesfrom colored sorghum genotypes[J].Food Res Int,2014,55：37-44.

[6]DYKESL,SEITZ L M,ROONEY WL,et al.Flavonoid composition of red sorghum genotypes[J].Food Chem,2009,116(1)：313-317.

[7]BETA T,ROONEY L W,MAROVATSANGA L T,et al.Phenolic compoundsand kernel characteristicsof Zimbabwean sorghums[J].J Sci Food Agr,1999,79：1003-1010.

[8]王桂梅.高粱胚乳性状的遗传研究[J].华北农学报，1987，2（2）：25-30.

[9]伊祖涛，张海艳.不同玉米品种角质和粉质胚乳淀粉粒的粒度分布特征[J].吉林农业科学，2015，40（4）：108-112.

[10]申瑞玲，陈 明，任贵兴.高粱淀粉的研究进展[J].中国粮油学报，2012，7（7）：123-128.

[11]郭旭凯，杨 玲，张福耀，等.高粱子粒理化特性与清香型大曲白酒酿造关系的研究[J].中国酿造，2016，35（12）：40-43.

[12]马 勇.中国白酒三十年发展报告（上）[J].酿酒科技，2016（3）：17-22.

[13]卫永太，张 镔，张桂香.中国高粱品质性状的区域性差异[J].天津农业科学，2016，22（11）：138-140.

[14]CHOPRA R,BUROW G,BURKE JJ,et al.Genome-wide association analysis of seedling traits in diverse sorghum germplasm under thermal stress[J].BMC Plant Biol,2017,17(1)：12.

[15]LASKY J R,UPADHYAYA H D,RAMU P,et al.Genome-environment associations in sorghum landraces predict adaptive traits[J].Sci Adv,2015,1(6)：e1400218.

[16]田晓红，谭 斌，谭洪卓，等.20种高粱淀粉特性[J].食品科学，2010，31（15）：13-20.

[17]宋旭东，史红梅，张海燕，等.工艺用高粱种质资源性状多样性分析[J].辽宁农业科学，2011（4）：31-33.

[18]王劲松，董二伟，武爱莲，等.不同香型白酒酿造高粱养分需求规律[J].山西农业科学，2016，44（7）：977-980.