响应面法优化固相微萃取生板栗香气成分条件

王圣仪，赵玉华，常学东*

（河北科技师范学院 食品科技学院，河北 秦皇岛 066000）

板栗（Castanea mollissima）是壳斗科栗属的植物，随着人们对板栗认识的提高，板栗加工制品受到越来越多的关注。板栗独特的香气是板栗制品增加的重要原因之一，生板栗具有复杂的鲜果香气，前人对生板栗的香气成分研究较少，国内外相关文献涉及的范围有限，关于板栗的分析研究侧重在不同的加工方式，对生板栗香气成分萃取方法的研究鲜有报道。

不同萃取方法对板栗挥发性香气成分的萃取结果有较大差异，选用不同的萃取技术并优化萃取条件，能为鉴别和提高生板栗的质量提供新的技术手段，同时为鉴定板栗特征风味提供基础的分析方法[1]。固相微萃取（solidphasemicroextraction，SPME）技术作为一项新颖的样品前处理与富集技术[2]，由于其取样后原样品体系组成不出现显著变化，可用于化学反应实时过程分析[3]，己经被广泛的应用于食品风味的分析检测中。

响应面法是一种常用的试验设计和数据处理方法，能通过一系列试验近似拟合得到多项式函数来预测真实情况，目前已广泛应用于天然产物的优化研究。本试验以早丰板栗为原料，使用响应面法优化固相微萃取技术对生板栗香气成分的提取条件，以期获得生板栗提取效果最优时的提取条件，为生板栗香气成分的萃取研究及气质联用法（gaschromatography-mass spectrometer，GC-MS）测定含量提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

早丰板栗：采于迁西县栗园，板栗成熟果实采后用保鲜膜包装后在贮藏库中4℃贮藏；高纯氦气（纯度99.999%）：河南源正科技发展有限公司。

1.2 仪器与设备

220-MS气相色谱-质谱联用仪：美国安捷伦公司；57330-U固相微萃取手动进样手柄、固相微萃取纤维头（100μm聚二甲基硅烷（polydimethylsiloxane，PDMS）、65μm PDMS/二乙烯苯（divinylbenzene，DVB）、75 μm Carboxen（CAR）/PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS）：美国Supelco公司；MS-TS分析天平：上海梅特勒-托利多仪器有限公司；DK-S22电热恒温水浴锅：上海精宏仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 试验条件

气相色谱条件：色谱柱为HP-5MS石英弹性毛细柱（30.0m×320μm×0.25μm），载气为氨气（He）（纯度99.999%），分流比20∶1，流速1.0 mL/min，进样口温度230 ℃，起始温度为40℃，保持3 min，以10℃/min升至180℃，保持3 min，再以10℃/min升至200℃，保持2 min。质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70 eV，离子源温度230℃，接口温度250℃，四极管温度150℃，质量扫描范围30～500 m/z。

萃取头的老化处理与试验流程：每支萃取头在首次使用时，需在气相色谱进样口于230℃老化30 min，以后每次使用前于230℃进样口处老化10 min以脱去其杂质。

试验流程：取饱满、无机械损伤的板栗果实，去壳后将栗仁切碎成体积约2.0 mm3的小块。准确称取样品2.0 g于15 mL顶空样品瓶内。将固相微萃取针管插入萃取瓶中并固定固相微萃取头在样品瓶中的位置，保持每次萃取时萃取头处于相同位置，伸出纤维头。吸附完成后，缩回纤维头后抽出针管，直接将萃取头插入气相色谱-质谱联用仪，于解吸温度230℃条件下进行解吸5 min。

1.3.2 单因素试验设计

影响固相微萃取过程中萃取效果的主要因素包括萃取头的种类、平衡时间、萃取时间以及萃取温度。优化试验以检出香气成分的数量和色谱峰的总峰面积为评价指标，先通过单因素试验考察各因素对顶空固相微萃取效果的影响[4]。

萃取头种类的优化：在平衡时间10 min，萃取时间30 min，萃取温度50℃的条件下，分别考察不同的萃取头（100 μm PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS、50/30μm DVB/CAR/PDMS）对萃取效果的影响。

平衡时间的优化：使用65μm PDMS/DVB的纤维头，在萃取时间30min，萃取温度50℃的条件下，分别考察不同平衡时间（0、5min、10min、15min、20min）对萃取效果的影响。

萃取时间的优化：使用65μm PDMS/DVB的纤维头，在平衡时间10 min，萃取温度50℃的条件下，分别考察不同萃取时间（20 min、30 min、40 min、50 min、60 min）对萃取效果的影响。

萃取温度的优化：使用65μm PDMS/DVB的纤维头，在平衡时间10 min，萃取时间30 min的条件下，分别考察不同萃取温度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）对萃取效果的影响。

1.3.3 响应面试验

在单因素试验的基础上，选择平衡时间（A）、萃取时间（B）和萃取温度（C）3个因素为自变量，以香气物质的萃取物种类为响应值（Y），根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理，综合单因素试验结果的基础采用3因素3水平的响应面分析方法[5]，响应面试验因素及水平见表1。

表1 萃取条件优化响应面试验因素与水平Table 1 Factor and levels of response surface methodology for extraction conditions optimization

1.3.4 定性定量分析

定性分析：通过GC-MS分析软件进行分析，化合物经计算机检索与计算机标准谱图库美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）11中的数据比较（最大值1 000），相似指数（similarity index，SI）＞800即为确认化合物。

定量分析：按峰面积归一法计算化合物相对含量。

2 结果与分析

2.1 单因素试验条件的优化

2.1.1 萃取头的选择[6]

图1 不同萃取头对萃取效果的影响Fig.1 Effects of different extraction fibers head on extraction efficiency

由图1可知，对生板栗香气成分的总吸附量来说，吸附能力由强到弱依次是100μm PDMS、65μm PDMS/DVB、50/30μm DVB/CAR/PDMS、75μm CAR/PDMS，吸附挥发性成分种类由多到少依次是65μm PDMS/DVB、100μm PDMS、50/30μm DVB/CAR/PDMS、75μm CAR/PDMS。

100μm PDMS是非极性的光纤维涂层，在挥发性物质的分析中广泛用于香气分析。这种纤维在提取板栗香气时得到了最高的总峰面积，但得到的萃取物种类少于65μm PDMS/DVB，对个别香气成分的萃取效果远高于其他香气成分，因此该纤维不适合生板栗香气的分析[7]。

混合极性的纤维涂层中65μm PDMS/DVB表现显著，DVB/CAR/PDMS纤维涂层的萃取范围广泛，对低沸点和高沸点的化合物有更好的萃取效果，而PDMS/DVB纤维涂层能吸收更多的极性和具有高保留指数（retention index，RI）的芳香族化合物[8]，在生板栗中萃取得到的化合物种类最多，且在混合极性的纤维涂层中65μm PDMS/DVB纤维的萃取头在板栗香气活性化合物中提取效率最高。因此，选择65μm PDMS/DVB纤维头为最适的萃取头。

2.1.2 平衡时间的选择

图2 不同平衡时间对萃取效果的影响Fig.2 Effects of different balance time on extraction efficiency

由图2可知，板栗香气成分的吸附量由多到少依次是平衡时间15 min、5 min、10 min、0 min、20 min；吸附挥发性成分种类由多到少依次是平衡时间15 min、10 min、5 min、20 min、0 min，说明平衡时间为15 min时，萃取到香气成分的种类最多且挥发性成分吸附量最大，因此选择15 min为最佳平衡时间。

2.1.3 萃取时间的选择[9]

图3 不同萃取时间对萃取效果的影响Fig.3 Effects of different extraction time on extraction efficiency

由图3可知，在萃取时间为50 min时，检出的香气成分种类最多，虽然在萃取时间为60 min时检出物的总峰面积略高与萃取时间50min，但检出香气成分种类减少，考虑到降低成本，使更多的样品可以在相同的时间内处理，因此选择50 min为最佳萃取时间。

2.1.4 萃取温度的选择[10-11]

图4 不同萃取温度对萃取效果的影响Fig.4 Effects of different extraction temperature on extraction efficiency

由图4可知，萃取香气成分种类随着萃取温度的升高而增加，检出的香气成分种类和总峰面积在萃取温度50～60℃时萃取效果相对稳定，温度到达70℃时香气种类与强度骤增。但在70℃萃取结束后，样品产生与熟板栗类似香气，为避免温度对目标样品产生影响改变样品理化性质，因此选择55℃为最佳萃取温度。

2.2 响应面试验

响应面试验结果与分析见表2。回归模型方差分析见表3。

表2 萃取条件优化响应面试验结果与分析Table 2 Results and analysis of response surface methodology for extraction conditions optimization

采用Design Expert软件对表2结果进行二次回归响应面回归分析，分别建立回归模型，得拟合方程：

表3 响应面试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface experiments

由表3可知，失拟项不显著，方程决定系数R2=0.940 8，校正决定系数R2adj=0.834 3，说明该模型与试验拟合良好。可以看出，萃取温度对萃取种类影响极显著（P＜0.01），平衡时间和萃取温度交互对萃取种类影响显著（P＜0.05），二次项A2、C2对萃取种类影响显著（P＜0.05）。通过所选3个因素的F值可知，对萃取种类的影响顺序依次为萃取温度、平衡时间、萃取时间。

采用Design Expert软件对以萃取种类最多为目标，对模型进行优化，可得到回归模型的稳定点（0.62，0.06，0.74），理想性为0.891，稳定点为最大值点，考虑到实际操作情况，选择萃取条件为平衡时间18 min，萃取时间50 min，萃取温度58.5℃，萃取种类达到21种，总峰面积为47 381.3。

由3 d重复分析挥发物的日间重复性评价方法，在相同样品相同条件下[13]对响应面试验得到的预测值进行连续3d验证试验。测得的萃取种类中，21种化合物被正确识别，总峰面积48 382.7，与理论值相差2.11%，说明应用响应面法优化得到的试验数据可靠，具有实用性价值。

板栗的生食与熟食在口感风味上存在明显差异，生板栗口感清脆略涩，味道清香甘甜，与生红薯味道相近。不同加工方式的熟板栗味道上略有不同，总体呈糯性酥性口感，味道浓郁，香而甜润。因此通过对栗仁进行感官评价可以对生板栗和熟板栗进行判断[14-17]。

采取1.3.1中栗仁处理方法，取24个15 mL萃取瓶分成三组，每个萃取瓶中放置颗粒大小约2.0 mm3立方体的新鲜栗仁2.0 g，分别置于50℃、60℃、70℃水浴锅中加热90 min，由8位熟悉板栗的实验室人员对三组不同水浴温度的栗仁进行评价。

其中50℃水浴温度下，8位评价人员均判定栗仁的香气口感味道与生板栗一致；60℃水浴温度下，1位评价人员认为栗仁口感轻微变糯，香气味道与生板栗一致，7位评价人员判定栗仁的香气口感味道与生板栗一致；在70℃水浴温度下，8位评价人员均闻出类似煮板栗香气，且部分口感变糯，味道处于生板栗与熟板栗混杂状态。因此萃取温度58.5℃时可以判定萃取后仍为生板栗。

表4 早丰板栗的挥发性物质含量测定结果Table 4 Determination results of volatile substances contents in ZaoFeng chestnut

2.3 SPME与GC-MS联用分析生早丰板栗香气成分的组成

采用优化后的顶空固相微萃取条件分析生早丰板栗中的风味物质组成，得到21种风味物质相对含量见表4。

续表

由表4可知，香气成分中醛类物质占14.40%、醇类物质占7.06%、酮类物质占7.72%、酯类物质占52.97%。

3 结论

本研究通过单因素研究，响应面优化条件后，选择出适宜生板栗香气成分的顶空固相微萃取的条件为：纤维头65μm聚二甲基硅烷/二乙烯苯（PDMS/DVB）、平衡时间18 min、萃取时间50 min、萃取温度58.5℃，在此优化萃取条件下，经过气质联用法检测出香气成分为21种，总峰面积48 382.7。其中醛类占14.40%、醇类占7.06%、酮类占7.72%、酯类占52.97%。说明固相微萃取与气相色谱质谱联用法可定性与定量分析生板栗的主要香气成分，为板栗风味成分的基础研究提供一种新的高效、快速、安全、节能的分析方法。

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