高效液相色谱法测定山楂黄酮的研究

李博艺，谌柄旭，魏志阳，王希彬，肖冬光*

（天津科技大学 生物工程学院 天津市工业微生物重点实验室，天津 300457）

山楂（Crataegus pinnatifida Bge.）为蔷薇科山楂属植物果实，又称山里红、山楂果、山梨、红果等[1-2]，在我国北方地区广泛栽培，是重要的药食同源植物。中国传统医学认为山楂具有消食健胃，行气散瘀，化浊降脂的作用；现代医学研究表明，山楂具有促进消化酶分泌，调节胃肠平滑肌、抗氧化、降血压、降血脂、抑菌等药理活性[3]。山楂中主要的生物活性成分包括黄酮类化合物、原花青素、三帖酸等[4-8]，目前从山楂中已分离得到60余种黄酮类化合物[9]。

山楂黄酮检测方法中，NaNO2-AL（NO3）3比色法是应用最广泛的[10]，样品以芦丁作为对照标准品，显色后在波长500～510 nm处测定总黄酮含量[11-13]，使用比色法检测山楂黄酮总含量在10～70 g/kg之间[14-16]。郭亚健等[17]通过筛选发现某些黄酮类化合物，如槲皮素、山柰素、黄芩素等在波长500～510 nm范围内无最大吸收或吸收较弱，而某些非黄酮类化合物如咖啡酸、绿原酸等却在该处有最大或较强吸收，在应用中可能造成黄酮类化合物假阴性和非黄酮类化合物假阳性干扰，方法专属性不强；同时黄酮类物质分类较广，种类繁多，一概以芦丁为对照品进行比对，检测结果误差较大。

液相色谱法将样品中单体物质分离检测，可以有效消除酚酸类物质对黄酮含量检测造成的影响[18-22]。孙立立等[23]对比色法测定山楂总黄酮含量与液相法测定山楂中金丝桃苷含量进行了对比；张永超等[24]使用高效液相色谱法对山楂中芦丁与槲皮素检测进行了方法学考察；陈宝龙等[25]采用高效液相色谱法建立了山楂药材黄酮类成分指纹图谱；王珍等[26]建立了全波长高效液相色谱法测定山楂总黄酮提取物中芦丁、金丝桃苷和槲皮素含量的方法。但在山楂黄酮类物质检测中，还存在色谱分离效果不好，准确定量分析方法未完善等不足。本研究对高效液相色谱（high performanceliquid chromatograph，HPLC）测定山楂中主要黄酮类物质的方法进行了优化，建立定性定量检测牡荆素、芦丁和槲皮素的方法，并对五个不同地区山楂样品中的主要黄酮类物质进行了分析检测，研究不同山楂果实中黄酮含量差异，旨在为山楂黄酮定量检测提供参考，为山楂资源综合利用、资源评价及深度开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山楂：分别购于天津、山西运城、河北邯郸、山东蒙阴山、山东莱芜；牡荆素、芦丁、槲皮素标准品（纯度均＞99%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；高效液相色谱检测所需试剂均为色谱纯，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

HPLC-UV高效液相色谱仪：美国Agilent公司；FA2204B电子天平：上海精密科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 山楂黄酮的提取

采用回流提取法[20]提取山楂黄酮类化合物：准确称取山楂细粉样品0.500 0 g，置于100 mL圆底烧瓶中，精密加入体积分数60%乙醇50 mL，称质量，水浴回流提取4 h，冷却至室温，称质量，补充损失的溶剂质量（精确至0.001 g），摇匀，使用孔径为0.22μm的滤膜过滤，滤液即为山楂黄酮提取液，备用。

1.3.2 色谱柱柱温的选择

高效液相色谱条件为：色谱柱Cosmosil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相A 100%甲醇，流动相B 1%乙酸；流速0.6mL/min；检测波长360nm，进样量20μL。分别在30℃、40℃、50℃柱温下，对山楂黄酮提取液进样分析，记录高效液相色谱图并进行对比。

1.3.3 梯度洗脱流程的确定

色谱条件同1.3.2，柱温30℃，梯度洗脱流程见表1，按4种梯度洗脱流程对山楂黄酮提取液进样分析，从而确定最佳梯度洗脱流程。

表1 不同HPLC流动相梯度洗脱时间表Table 1 Gradient elution schedules for different HPLC mobile phases

1.3.4 标准溶液的制备

准确称取牡荆素0.010 0 g、芦丁0.020 0 g和槲皮素0.020 0 g，分别用甲醇溶解定容至50 mL容量瓶中，得到标准储备液，按表2稀释成不同质量浓度的标准使用液。

表2 混合标准溶液中各标准品的质量浓度Table 2 Concentration of each standard substance in the mixed standard solution

1.3.5 不同地区山楂黄酮相似度分析

取5个不同地区山楂样品，按1.3.1方法制备山楂黄酮提取液，并按照优化后液相色谱检测方法进行分析，记录液相色谱图。运用中国药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”对5组山楂黄酮样品的液相色谱图进行分析。

2 结果与分析

2.1 色谱柱柱温的选择

按1.3.2的方法，在柱温为30℃、40℃、50℃条件下，对山楂黄酮提取液进行分析得色谱图，结果见图1。由图1可知，随着柱温的升高，柱压下降，洗脱效率增强，几种物质出峰时间均有所提前。在40℃和50℃时，色谱图在20～30 min间出峰过于密集，不利于各种物质的分离辨别，对比色谱图的分离效果，确定30℃为最佳柱温。

图1 不同柱温山楂样品高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of hawthorn sample with different column temperature

2.2 液相色谱梯度洗脱流程优化

按照1.3.3中的方法，以4种梯度洗脱流程对供试样品进样分析，色谱图见图2。由图2可知，流程Ⅰ起始水相比例较高，牡荆素峰与杂质峰混在一起，无法分离；随着起始有机相比例的升高，流程Ⅱ、流程III、流程IV中物质的出峰时间逐渐提前，20～30 min之间物质出峰也更加密集，在流程Ⅱ中，牡荆素与杂峰分离效果较好，色谱基线更加平稳，读取数据更加准确。所以选择流程Ⅱ为山楂黄酮检测梯度洗脱流程。

图2 不同流动相梯度洗脱程序高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of different mobile phase gradient elution procedures

2.3 外标法测定山楂中主要黄酮含量

山楂黄酮提取液与标准溶液的色谱图见图3，对照标准品色谱图，山楂样品液在相同保留时间出现了牡荆素、芦丁、槲皮素的色谱峰，且峰形较好。

图3 3种对照标准品混合溶液(A)和山楂样品(B)的高效液相色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of 3 mixtures standard solutions(A)and hawthorn sample(B)

按表2制备不同质量浓度的标准溶液，分别进样20μL，按照优化后液相色谱条件进行测定，以进样量对色谱峰面积进行最小二乘法线性回归，分别建立各标准品的回归方程，结果见表3。由表3可知，牡荆素、芦丁、槲皮素的保留时间分别为25.59 min、30.76 min和46.68 min，回归方程的线性范围分别为1～100 mg/L、1～120 mg/L和1～40 mg/L，相关系数在0.999 2～0.999 7，表明线性关系较好，3种黄酮的检出限为0.020～0.082 mg/L，定量限为0.065～0.253 mg/L。

表3 标准品的保留时间、线性回归方程、相关系数和线性范围(n=6)Table 3 Retention time,linear regression equation,correlation coefficient and linear range of standard substances(n=6)

2.4 方法学考察

2.4.1 重复性试验

准确称取山楂样品，按照1.3.1的方法制备山楂黄酮提取液，采用优化后的色谱条件测定山楂中三种主要黄酮含量，6次平行试验结果见表4。由表4可知，各共有峰相对保留时间的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）均＜5%，三种主要黄酮含量的RSD均＜5%，表明该方法重复性良好，符合定性定量检测要求。

表4 重复性实验结果Table 4 Results of repeatability tests

2.4.2 稳定性试验

精确称取样品，按照1.3.1的方法制备山楂黄酮提取液，分别放置0、1 h、2 h、4 h、8 h后进行高效液相色谱测定，实验结果见表5。由表5可知，各黄酮含量的RSD均＜5%，表明山楂黄酮提取液在8 h内稳定。

表5 稳定性试验结果Table 5 Results of stability tests

2.4.3 回收率试验

准确称取已知黄酮含量的同一批山楂样品3份，每份约0.500 0 g，加入与样品中含量大致相等的标准品，按1.3.1操作，制备山楂黄酮提取液，依优化后色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表6。由表6可知，三种物质加标回收率在99.63%～104.76%之间，相对标准偏差（RSD）值均低于5%，符合定量检测要求。

表6 加标回收率实验结果（n=3）Table 6 Results of adding standard recovery rate（n=3）

2.5 不同地区山楂主要黄酮含量的检测

2.5.1 不同地区山楂黄酮类物质液相色谱图相似度分析

按1.3.5方法，对5组山楂黄酮样品的液相色谱图进行分析，设定河北邯郸样品为参照图谱，选取“时间窗宽度”为0.1 min，采用中位数法计算，选定3个特征峰进行多点校正，自动匹配，生成山楂黄酮成分的对照指纹图谱，见图4，匹配后的5批样品色谱图见图5。由图5可知，五个不同地区山楂样品均有牡荆素、芦丁和槲皮素的色谱峰，且均以芦丁为主要黄酮物质。

图4 山楂标准品的高效液相色谱图Fig.4 HPLC chromatograms of hawthorn standard

以对照指纹图谱为参照，进行各样品的相似度评价，5个不同地区山楂样品相似度关系见表7。由表7可知，五组样品与对照色谱图谱相似度在0.772～0.993，说明各产地的山楂样品差别较大；另一方面，来自于山东省的两个山楂样品（S1、S2）和来自于天津和河北的两个山楂样品（S3、S5）相似度分别为0.938和0.996，说明产地相近的山楂样品相似度较高。

图5 5个不同地区山楂样品高效液相色谱指纹图谱Fig.5 HPLC fingerprint of hawthorn samples in five different regions

表7 5个不同地区山楂样品高效液相色谱图相似度结果Table 7 Similarity results of hawthorn samples in five different regions by HPLC

2.5.2 不同地区山楂样品主要黄酮含量测定

对5个不同地区山楂的黄酮类物质进行定量分析，结果见表8。由表8可知，不同地区山楂主要黄酮类物质总量相差较大，最高的是山东蒙阴山山楂（897.80 mg/kg），最低的为天津山楂（420.47 mg/kg），其中牡荆素和槲皮素的含量差别较小，而芦丁的含量差别较大，山东地区山楂中芦丁的含量约为天津地区的4倍。

表8 不同地区山楂黄酮含量测定结果Table 8 Determination results of hawthorn flavonoids in different regions mg/kg

3 结论

通过对高效液相色谱测定山楂黄酮方法的优化，建立了外标法定量测定山楂中牡荆素、芦丁和槲皮素含量的方法，方法学验证结果表明，重复性试验RSD为1.73%，稳定性试验RSD为1.04%，加标回收率为99.63%～104.8%，说明此方法重复性高，稳定性好，具有较好的准确性。

对5种不同地区山楂样品黄酮类物质色谱图的相似度分析，结果表明不同地区山楂黄酮类物质组成相差较大，受到地域环境条件、成熟度、采摘年份等多种因素影响，山楂黄酮的组成和含量都可能存在较大的差别，其中芦丁含量的差别最为明显。

本研究采用高效液相色谱法检测山楂中三种主要黄酮的总量仅为420.47～897.80 mg/kg，与比色法所测的黄酮总量相差较大。分析原因主要包括两个方面：一是目前从山楂中已分离得到黄酮类化合物有60余种，而本方法仅定量分析了其中三种主要的黄酮；另一方面，比色法的测定原理为利用类黄酮结构上的酚羟基特征及其还原性进行显色，只要有邻二羟基或有3,5位羟基结构的化合物，都会与NaNO2-AL（NO3）3显色剂发生显色反应，对黄酮而言显色剂NaNO2-AL（NO3）3并不具有专属性，而许多酚酸类物质也含有类似结构，从而导致山楂总黄酮检测结果的数据偏大。如何准确定量测定山楂总黄酮含量，有待进一步研究。

参考文献：

[1]于蓓蓓，闫雪生，孙丹丹.山楂药理作用及其机制研究进展[J].中南药学，2015（7）：745-748.

[2]王 玲，吴军林，吴清平，等.山楂降血脂作用和机理研究进展[J].食品科学，2015，36（15）：245-248.

[3]崔 亮，华二伟，薛 洁.山楂对消化系统影响的研究进展[J].新疆中医药，2012，30（1）：78-79.

[4]SOKOÓŁŁETOWSKA A,OSZMIANN′SKIJ,WOJDYŁOA.Antioxidant activity of the phenolic compounds of hawthorn,pine and skullcap[J].Food Chem,2007,103(3)：853-859.

[5]GARCÍA-MATEOSR,IBARRA-ESTRADA E,NIETO-ANGEL R.Antioxidant compounds in hawthorn fruits(Crataegus spp.)of Mexico[J].Revista Mexicana De Biodiversidad,2013,84(4)：1298-1304.

[6]SVEDSTRÖM U,VUORELA H,KOSTIAINENR,et al.Fractionation of polyphenolsin hawthorn into polymeric procyanidins,phenolic acidsand flavonoids prior to high-performance liquid chromatographic analysis[J].J Chromatogr A,2006,1112(1-2)：103-111.

[7]LIU JL,YUAN JF,ZHANG Z Q.Microwave-assisted extraction optimised with response surface methodology and antioxidant activity of polyphenols from hawthorn(Crataegus pinnatifida Bge.)fruit[J].Int J Food Sci Technol,2010,45(11)：2400-2406.

[8]MRAIHIF,HIDALGO M,PASCUAL-TERESA SD,et al.Wild grown red and yellow hawthorn fruitsfrom Tunisia assource of antioxidants[J].Arabian J Chem,2015,8(4)：570-578.

[9]沈燕琳，董文轩，李 鲜，等.山楂酚类物质及其生物活性研究进展[J].园艺学报，2013，40（9）：1691-1700.

[10]何珺，颜仁梁，刘志刚.NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法测定总黄酮应用中的常见问题[J].今日药学，2009，19（12）：18-21.

[11]黄优生，谢明勇，张中伟，等.山楂总黄酮的测定[J].南昌大学学报：理科版，2006，30（5）：473-477.

[12]张 文，霍丹群.微波法提取山楂总黄酮的初步工艺研究[J].中成药，2006，28（11）：1667-1669.

[13]王 洁，吴海霞.超声辅助提取山楂总黄酮的工艺研究[J].运城学院学报，2016，34（6）：31-34.

[14]张 雪，丁长河.紫外分光光度法检测山楂总黄酮方法的建立[J].食品工业科技，2007，28（7）：200-202.

[15]霍丹群，张 文，李奇琳，等.超声波法与热提取法提取山楂总黄酮的比较研究[J].中成药，2004，26（12）：1063-1065.

[16]陈尚鑫.测定山楂总黄酮含量的方法学考察[J].医药前沿，2017，7（1）：354-355.

[17]郭亚健，范莉.关于NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法测定总黄酮方法的探讨[J].药物分析杂志，2002（2）：97-99.

[18]KRAHL M,BACK W,ZARNKOW M,et al.Determination of optimised malting conditions for the enrichment of rutin,vitexin and orientinin commonbuckwheat(Fagopyrum esculentum Moench)[J].J Inst Brew,2015,114(4)：294-299.

[19]SAGARADZE V A,BABAEVA E Y,KALENIKOVA E I.HPLC-UV method for determing flavonoids in hawthorn flowers and leaves[J].Pharmaceut Chem J,2017,51(4)：277-280.

[20]WANG C H,WANG Y X,LIU H J.Validation and application by HPLCfor simultaneousdetermination of vitexin-2"-O-glucoside,vitexin-2"-O-rhamnoside,rutin,vitexin,and hyperoside[J].J Pharmaceut Anal,2011,1(4)：291-296.

[21]孙协军，李秀霞，刘雪飞，等.山楂黄酮超声波辅助提取工艺参数优化研究[J].食品工业科技，2014，35（9）：203-207.

[22]暴凤伟，刘玉强，张振秋，等.HPLC法测定山楂提取物中芦丁、金丝桃苷、槲皮素的含量[J].中华中医药学刊，2013（2）：246-248.

[23]孙立立，谢鸿霞，孙敬勇，等.比色法测定山楂中总黄酮的含量[J].中成药，2001，23（10）：748-750.

[24]张永超，哈云利，唐大力，等.高效液相色谱法测定山楂中芦丁和槲皮素的含量[J].化学工程师，2006，20（3）：28，53.

[25]陈宝龙，郑朝华，陈玉英.山楂药材黄酮类成分HPLC指纹图谱的研究[J].中国新药杂志，2005，14（1）：80-82.

[26]王 珍，李秀霞，李 娇，等.高效液相色谱法测定山楂中芦丁、金丝桃苷和槲皮素的含量[J].食品工业科技，2013，34（9）：302-305.