弥漫性大B细胞淋巴瘤患者HGAL和miR-155的相关性研究

卢杰，高莉莉，邓珊珊，程丹丹，姜世君

（大庆医学高等专科学校，黑龙江 大庆 163312）

肿瘤是一种多基因疾病，目前已发现的与肿瘤相关的基因在500种以上，肿瘤分子病因的复杂性和多样性决定了肿瘤研究工作的艰巨性，淋巴细胞发生了恶变即称为淋巴瘤，按照“世界卫生组织淋巴系统肿瘤病理分类标准”大体可分为霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤两大类。在我国，弥漫大B细胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤中最常见的类型，几乎占所有病例的1/3，主要是“侵袭性”或“中高度恶性”淋巴瘤。DLBCL的诊断可以依据典型的临床表现，如淋巴结肿大。目前，唯一可靠的诊断DLBCL的标准是组织病理学检查结果[1]。因而发掘弥漫大B细胞淋巴瘤肿瘤标志物是非常有必要，本项目检测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者和正常体检者miR-155、HGAL和RhoA的相对表达水平，探讨miR-155与HGAL及RhoA的关系，及以上诊断标志物与弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）发生进展的关系，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器 TRIZOL、Lipo2000购自美国Invitrogen公司；M-MLV逆转录酶、dNTP、DL2000、SYBR Real Time试剂盒，购自 TaKaRa公司；RNase Inhibitor、DNase I、Loading Buffer购自美国Fermentas公司；Real Time PCR 8联管购自美国BIO-RAD公司；血清总蛋白提取试剂盒，普利莱基因技术有限公司；2720型PCR仪为美国ABI公司产品，Chromo4荧光定量PCR仪为美国BIO-RAD公司产品。Anti-GCET2/HGAL antibody(ab89180)，Anti-RhoA antibody(ab54835)，Anti-GAPDH antibody(ab37168)购自ABCAM公司。miR-155 mimics由上海生工生物工程有限公司合成；Dual-Luciferase® Reporter Assay System，E1910为Promega公司产品；荧光酶标仪微孔板检测系统是Spectra Max M5e。

1.2 方法 ①样品的采集：采集大庆市龙南医院新入院且未放化疗或手术的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者静脉血20份，以EDTA-K2抗凝管采集抗凝血，取职工体检时抽取的静脉血作对照，经病理类型组织细胞学、影像学、临床表现等确诊。②引物设计：Primer premier 5.0软件设计并合成特异性引物。引物设计情况：HGAL：正向引物：GAGAAAACAGGCGGCAGC-3’；反向引物：GCAGAAACACCCTTCAGCG-3’，产物长度116 bp。RhoA：正向引物：ATTGTTGGTGATGGAGCCTGT-3’；反向引物：CCCACAAAGCCAACTCTACCT-3’，产物长度148 bp。GAPDH：正向引物：ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’；反向引物：GTTGAGGTCAATGAAGGGGTC-3’，产物长度123 bp。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。miR-155：RT引物：CGCTGCTACCTGAGAGTAGACCAGATGCAGCGACCCCT；正向引物：TTAATGCTAATCGTGATAG；反向引物：ACCTGAGAGTAGACCAGA；产物长度 48bp。U6：RT引物：AACGCTTCACGAATTTGCGT；正向引物：CTCGCTTCGGCAGCACA；反向引物：AACGCTTCACGAATTTGCGT；产物长度94 bp。③总RNA的提取：用TRIZOL通用型RNA快速提取试剂盒，提取样品RNA，最后加入30µl无RNase的水，溶解RNA。④RNA反转录为cDNA：RNA反转录为cDNA的操作程序如下：4µlRNA模板、2µl RT-buffer、1µl dNTP、1µl OligodT引物、10µl DEPC水，混匀，70 ℃ 5 min，立即冰浴，加入1 µl RNase Inhibitor、1 µl M-MLV，反应条件：30 ℃ 10 min；42 ℃ 60 min；70℃ 10 min。⑤Real Time PCR检测：取0.2 ml薄壁PCR管，分别编号，体系如下：SYBR Premix Ex TaqTM（2×），10 μl；PCR 正向引物（10 μM），1 μl；PCR 反向引物（10μM），1μl；Rox（50×），0.4μl；cDNA模板，1μl；ddH2O，6.6 μl；20.0 μl反应体系。混匀，置于荧光定量PCR仪中。变性，95℃ 30 s；40个循环：95℃ 5 s，60℃ 15 s；溶解曲线：95℃ 15 min；60℃ 1 min；95℃ 15 min；用不含cDNA模板的ddH2O作为阴性对照，用GAPDH作为内参。可以通过溶解曲线验证引物的特异性和结果的可信度。采用2-△△Ct法计算基因的相对表达量。⑥western-blotting试验：首先提取血清中的总蛋白，每100µl血清样本加入200µl含蛋白酶抑制剂的蛋白提取解液，之后放冰上30min；14000 rpm离心20 min；取上清，加入4x蛋白Loading buffer，进行SDSPAGE电泳和western-blotting检测。采用ECL发光检测：将ECL化学发光试剂盒中的试剂A和B进行等体积混匀，然后滴到PVDF膜上，2 min后，将PVDF膜放到保鲜膜上，用滤纸将残余液体吸干，保鲜膜覆盖完全，在暗盒内将膜与X胶片曝光约5 min，然后用显影液显影后再用定影液进行定影。用图像分析系统对Western blot目的条带进行灰度测定，再用Quantity One软件对该结果进行灰度分析。⑦双荧光素酶检测结果a：pSicheck-2-3UTR载体的构建：HGAL3′-UTR（长度2 613 bp）扩增引物：上游引物：CCGCTCGAGTGAAGTGGCTGGACTAGCATTTG-3’下游引物：ATAAGAATGCCCGGGCTTTGGGACATTAAAATTTATTTACTGG-3’；PCR产物和pSicheck-2载体分别用XhoI和NotI进行双酶切，然后进行连接，转化到top10大肠杆菌中，次日挑取克隆进行酶切鉴定和测序验证。阳性克隆命名为pSicheck-HGAL-UTR。b：HELA细胞培养和共转染：转染前24 h接种HELA细胞到96孔细胞培养板；次日早晨细胞长至85%密度的时候按照以下准备转染材料，见表1。

表1 转染体系（µl）Table 1 Transfection system(µl)

pSicheck-HGAL-UTR、miR-155mimic和miR-155NC均为100 ng/µl。表达质粒和报告质粒以脂质体法（Lipofectamine 2 000）瞬时转染HELA细胞，按照上表的量转染。转染后48 h后提取HELA细胞总蛋白。参考E1910试剂盒进行海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶的活性检测；用Graph-Pad Prism 4.0软件对结果进行分析。

2 结果

2.1 MicroRNA荧光定量PCR结果 检测DLBCL患者和健康人血清中的miR-155，见图1。由图可以看出，DLBCL患者血清中的miR-155高于健康人，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 荧光定量PCR结果 对HGAL和RhoA进行荧光定量PCR，见图2。由图可以看出，DLBCL患者血中HGAL和RhoA mRNA表达都低于正常人，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 miRNA荧光定量PCR结果Figure 1 Quantification results of miRNAdetected by Quantitative Real-time PCR

图2 HGAL和RhoA荧光定量PCR结果Figure 2 Quantification results of HGAL and RhoAdetected by by Quantitative Real-time PCR

2.3 western-blotting结果 对HGAL和RhoA进行荧光定量PCR，见图3。由图可以看出，DLBCL患者血清中HGAL和RhoA蛋白表达都低于正常人，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图3 HGAL和RhoA western-blotting结果Figure 3 HGALand RhoAexpression by western-blotting注：A：western-blotting结果；B：数值化处理结果

2.4 双荧光素酶检测结果 pSicheck-HGAL-UTR克隆分别用XhoI和NotI进行的双酶切，见图4。可以看出得到2 600 bp左右的HGAL 3′-UTR的PCR产物大小和pSicheck-2载体大小约6 200 bp的两个特异性条带。说明成功将HGAL 3′-UTR克隆到了pSicheck-2载体中，因此可以进行下一步转染试验。

为了研究miR-155与HGAL表达的相关性，我们构建了HGAL的3′-UTR的双荧光素酶报告基因载体。同时分三组进行试验：第一组：UTR+NC组，即转染一个pSicheck-2-HGALUTR载体和mimic NC组；第二组：UTR+miR-155组，即转染一个pSicheck-2-HGAL-UTR载体和能与之3′-UTR结合的miR-155 mimics；第三组：miR-155+vec组，即只转染miR-155 mimics和pSicheck-2载体。之后对双荧光素酶进行鉴定，见图5。由图可以看出，第一组的比值高于第二组和第三组，差异有统计学意义（P＜0.05），原因是HGAL的3′-UTR能够增强hRluc的表达；第二组的值低于第一组的原因是，miR-155和HGAL的3′-UTR结合后，降低了hRluc的表达。第二组的值高于第三组的原因是，hRluc没有3′-UTR的作用，因此表达很低，同时，miR-155也没有发挥作用。

图4 pSicheck-2-HGAL-UTR双酶切鉴定结果Figure 4 pSicheck-2-HGAL-UTR digested and characterized注：1：DL15 000 DNA Marker：250,1 000,2 500,5 000,75 000,1 000,15 000 bp；2：pSicheck-2-HGAL-UTR用XhoI和NotI进行的双酶切鉴定结果

图5 双荧光素酶检测结果Figure 5 Resuts of dual luciferase

3 讨论

微小RNA（MicroRNAs，miRNAs）是长度约22 nt的内源性单链小RNA，来源于染色体上的非编码区，具有高度的保守性[2]。可与编码蛋白质的mRNA互补结合，沉默，降解或抑制其表达，参与调控基因遗传、生长发育、应激反应、新陈代谢、细胞增殖、分化、凋亡、肿瘤形成及疾病发生发展等多种生物学过程[3]，目前已经证实，miRNAs在血清中表现为显著的肿瘤相关性、组织特异性和表达稳定性。已发现miRNAs在几乎所有人类癌症中都有表达失调，血清和体液中含有足够稳定的miRNA的表达[4]。miRNAs有望成为功能性预后血清标志物和药物反应的研究对象[5]，是基因表达的关键调控因子[6]。

血清miRNAs可能是一种理想的肿瘤标志物。肿瘤miRNA在血液中的存在可能是肿瘤死亡、溶解或者由肿瘤细胞释放出miRNA到其周围环境的结果[7]。研究表明，miRNAs在弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的血清中是非常丰富的。目前已清楚，miR-155为具有致癌潜能的miRNAs之一[8]，在弥漫性大B细胞淋巴瘤的细胞增殖、细胞循环、细胞凋亡发挥重要作用[9]。葛等实验表明，B细胞型非霍奇金淋巴瘤组血浆中miR-155表达量明显高于正常对照组和淋巴结炎性肿大组[10]。Eis等用定量RT-PCR证明了原发性纵隔B细胞淋巴瘤中BIC的表达与miR-155的水平一致，表明BIC为miR-155的前体[11]。

将蛋白质组学技术具体应用到肿瘤研究中，就产生了肿瘤蛋白质组的学科。它以寻找肿瘤标志物为目的，以蛋白质组学方法为手段，结合肿瘤分子机制的基础研究与肿瘤检测、诊断等临床研究，最终找到能应用于临床的肿瘤检测和治疗的蛋白质靶标。miR-155可以通过BMP/TGF-β和Rho A等多种信号通路促进淋巴瘤的发生[12]，Huang等利用蛋白组学的方法揭示了，在弥漫大B细胞性淋巴瘤中miR-155直接与PIK3R1（p85α）3'-非编码区互动，miR-155过表达下调p85α的转录和翻译，大大激活了PI3K-Akt通路，从而解释了miR-155在DLBCL作用的新的分子靶标[13]。应用IHC对四种差异表达蛋白EZR、PLEK、GSTP1、HSPB1蛋白表达在DLBCL组织样本中进行验证，初步确定这四种蛋白质表达与DLBCL的化疗敏感性相关[14]。在B细胞不同分化阶段发生肿瘤转化而形成的DLBCL，提示不同的癌基因起源，包括BCL-6、HGAL、CD10、CD5、FOXP1等，并且这些癌基因标志物与患者预后相关[15]。

miR-155通过结合HGAL基因的3'非编码区来直接下调其表达，以减少RhoA的活化作用，增强自发的或由某些化学诱导物导致的淋巴瘤细胞的能动性。Dagan等实验发现，转染了hsa-miR-155的细胞不仅HGAL蛋白的表达水平降低，而且HGAL mRNA的水平也下降了，说明miR-155不仅直接与HGAL基因的3'-UTR结合，降低蛋白的表达，而且干扰了HGAL mRNA的稳定性[16]。

本研究通过实验发现DLBCL中的miR-155显著高于，以及HGAL和RhoA显著低于正常人；用双荧光素酶报告基因检测发现，miR-155能与HGAL的3′-UTR结合，进而降低hRluc的表达，间接表明，在体内，miR-155能与HGAL的3′-UTR结合降低HGAL的表达。因此认为DLBCL中HGAL的下调与miR-155的表达升高有关，miR-155和HGAL可以作为弥漫性大B细胞淋巴瘤的检测标志物。而且这种外周血检测方法，具有无创伤、易于检测，可重复性高等优点[17]，因而外周血miRNA和蛋白质组合检测可作为肿瘤早期诊断的标志物。