基于超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术研究苦参醇提物致大鼠肝毒性的尿液代谢组

姜 鹏，孙言才，蔡 颖，王欣晨

(中国科学技术大学附属第一医院西区 安徽省肿瘤医院药剂科，安徽 合肥 230031)

苦参(Sophoraflavescens)为豆科槐属植物苦参的干燥根，始载于《神农本草经》，为常用的中药，临床上主要用于治疗各种肝炎、癌症、病毒性心肌炎、胃肠出血和皮肤病[1]。大量中药产品中都含有苦参，例如消银片、苦参片、当归苦参丸、湿毒清胶囊和痔血胶囊等。其中痔血胶囊由于其严重的肝毒性被国家食品药品监督管理局召回[2-3]，前期研究发现苦参是痔血胶囊中产生肝毒性的药物[4]，但苦参引起的肝毒性机制尚不清楚。一般而言，临床上苦参多用水煎液，苦参水提物主要含苦参碱和氧化苦参碱等生物碱类成分，具有保肝作用；而苦参醇提物主要含有苦参酮和槐属二轻黄酮G等异戊烯基黄酮类成分[4]，是苦参主要的肝毒性成分，许多中药制剂含有苦参的醇提物，其临床用药带来的风险不容忽视。

代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后迅速发展起来的组学技术，是机体面对内源性和外源性化合物后体内所有代谢物的变化轮廓，是研究复杂系统的一种重要研究工具[5]。代谢组学与其他组学相比，数据处理相对简单，取样(主要为尿液和血液)方便，对机体没有侵入性，可以对机体进行动态观察，反映实际的毒性作用，在化合物的毒性筛选、临床前和临床药物的毒性评价和作用机制研究方面有着广泛应用[6-8]。对于中药这种复杂的系统，代谢组学在研究中药的作用或毒性机制方面有着明显优势[9-10]。目前，代谢组学常用的分析方法主要包括质谱技术、核磁共振检测技术和色谱-质谱联用技术等，尤其是超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术(ultra-performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry，UPLC-HRMS)具有检测速度快、灵敏度高、能选择性定性和定量检测多种代谢物的特点，为代谢组学研究提供了有力的工具。本课题组前期已经开展了苦参干预后大鼠的血清代谢组学研究[11]，大鼠灌胃给予苦参醇提物(Sophora flavescens alcohol extract，SFAE)14 d后，肝脏病理检查和血清生化指标均表明大鼠产生明显的肝毒性，在此基础上，利用UPLC-HRMS技术，检测大鼠灌胃给药SFAE 14 d后尿液中代谢物的变化，并结合模式识别分析，寻找潜在的生物标志物，揭示SFAE给药前后内源性代谢物的变化趋势，探讨SFAE产生作用的代谢通路，为研究SFAE的肝毒性机制提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器 UPLC-LTQ-Orbitrap system色谱-质谱联用仪：德国Thermo公司；XS105DU型电子天平：美国Mettler Toledo公司；QT-1型涡旋混合器：上海琪特分析仪器有限公司；1730R型冷冻离心机：丹麦Scan Speed公司；Millipore Milli-Q纯水机。

1.2 试剂 苦参：上海康桥中药饮片有限公司；叠氮化钠：上海国药集团化学试剂有限公司；对照品焦谷氨酸、去氧胆酸、肌酸、卡马西平、胆酸、甘氨胆酸和霉酚酸：均购于美国Sigma公司；甘氨酸、酮戊二酸、丙酮酸、脯氨酸、琥珀酸和柠檬酸：均购于上海源叶生物科技有限公司；色谱纯甲醇、乙腈：购于韩国Burdick & Jackson公司；甲酸(批号 FS0830-15)：美国Tedia公司。

2 方法

2.1 SFAE的制备 根据实验室前期报道的方法[4]制备苦参粉末。称取苦参干燥根，采用70%乙醇回流提取法提取2次，每次提取4 h，将所得浓缩液合并过滤后再旋蒸浓缩，所得膏状药物在70 ℃经真空干燥得SFAE，1 g SFAE相当于20 g生药量。

2.2 动物分组及给药 雄性清洁级SD大鼠，体质量(200±20)g，购于上海必凯实验动物有限公司[生产许可证号为SCXK(沪)2013-0016]，由复旦大学药学院动物实验中心提供。自由摄食饮水，适应性饲养1周，12 h明暗循环。实验前12 h禁食，自由饮水。

取18只SD大鼠随机分为3组，每组6只，对照组给予1%吐温80溶液；SFAE低剂量组(1.25 g/kg相当于临床常用剂量的25倍)、高剂量组分别称取12.5、25 g SFAE，用200 mL 1%吐温80制成混悬液，给药前充分振摇均匀。各组动物每天灌胃给药1次，灌胃容积均为20 mL/kg，连续给药14 d。

2.3 大鼠尿液采集 大鼠分别单独置于代谢笼中，将加入0.2%叠氮化钠的玻璃试管置于冰上，收集末次给药后12 h大鼠尿液，将收集的尿液以4 000×g离心10 min，取上清液存于-80 ℃冰箱备用。

2.4 尿样的制备 将尿液用超纯水稀释20倍后精密吸取50 μL，加入250 μL含内标的甲醇(卡马西平60 ng/mL，霉酚酸700 ng/mL)，涡旋混匀5 min，在4 ℃条件下，16 000 r/min高速离心10 min，取上清液进样5 μL分析。

2.5 色谱和质谱条件

2.5.1 色谱条件 色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18column(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)。流动相：0.1%甲酸/水(A)和乙腈(B)。梯度洗脱程序：0～1.0 min，90% A；1.0～2.0 min，90%→60% A；2.0～11.0 min，60%→40% A；11.0～14.0 min，40%→10% A；14.0～15.0 min，10% A；15.0～15.5 min，10%→90% A；15.5～20.0 min，90% A。流速：0.3 mL/min。柱温：35 ℃。自动进样器温度：4 ℃。进样量：5 μL。

2.5.2 质谱条件 离子源为电喷雾离子源(ESI)；正、负离子分别监测模式；辅助气流速：15单位；鞘气流速：45单位；喷雾电压：正极为3.8 kV，负极为-3.2 kV；毛细管温度：350 ℃；加热部件温度：300 ℃；扫描范围为m/z50～1 000。

2.6 数据处理与分析 采用仪器配套软件SIEVE进行色谱峰提取和峰匹配，所得的数据输出到Excel表中进行预处理。将预处理得到的数据导入SIMCA-P 13.0软件进行无监督识别模式识别方法——主成分分析(principal components analysis, PCA)和有监督模式识别方法——正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)。OPLS-DA模型中得到变量的投影重要性(variable importance in projection，VIP)值，可评价不同变量与分类的相关程度，如果VIP值>1，表明该变量对分类的贡献比较大，以VIP>1为标准筛选变量。此外，对于筛选变量进行Kruskal-WallisH检验，只有同时满足VIP>1和P<0.05的变量才被认为是差异有统计学意义的变量。将筛选得到的差异有统计学意义的变量通过保留时间、加合离子信息、精确分子量和对照品比对，同时检索HMDB(http://www.hmdb.ca)、KEGG(http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)、Metlin(http://metlin.scripps.edu)等数据库，鉴定差异代谢物的结构并构建代谢通路。

2.7 方法学考察 从所有尿液样本中取等容积的尿液，混匀得到尿液质控(quality control, QC)样本。将QC样本与尿液样本按照同样的方法进行处理，并在进样时每隔3个尿液样本插入1个QC样本。通过观察QC样本在PCA得分图上的聚集度，考察分析方法的稳定性。

3 结果

3.1 大鼠尿液代谢物轮廓分析 采用软件SIEVE进行色谱峰提取和峰匹配，比较3组样本负离子和正离子的典型基峰色谱图(见图1)，发现组间色谱峰存在明显差异，特别是负离子检测模式下，4～10 min内峰形、峰强和峰位变化显著，初步说明大鼠给予不同剂量苦参后，对照组和给药组尿液代谢物轮廓发生显著改变。

3.2 大鼠尿液代谢组PCA和OPLS-DA分析 将经过预处理后数据导入SIMCA-P软件进行多变量统计分析，采用PCA和OPLS-DA对对照组和给药组尿液代谢物的LC-MS数据进行分析。PCA得分图(图2A、图2B)显示，在正、负离子模式下，QC样本聚集程度高，且可与其他各组样本区分，说明样本前处理及分析方法稳定可靠；对照组和给药组尿液代谢物能够被明显区分开，说明给予SFAE后大鼠体内环境出现显著变化。OPLS-DA得分图(图2C、图2D、图2E、图2F)显示，在正、负离子模式下，对照组和SFAE低剂量组、对照组与SFAE高剂量组间区分明显，模型参数R2X>0.8，R2Y>0.9，Q2>0.9，说明模型稳定、可靠，预测能力高，提示组间代谢轮廓谱存在明显差异。

图1 大鼠尿液的LC-MS基峰色谱图(m/z 50～1 000)

注：A.R2X=0.829，Q2=0.751；B.R2X=0.851，Q2=0.814；C.R2X=0.963，R2Y=0.997，Q2=0.966；D.R2X=0.955，R2Y=0.998，Q2=0.972；E.R2X=0.884，R2Y=0.999，Q2=0.994；F.R2X=0.905，R2Y=0.999，Q2=0.991

图2大鼠尿液LC-MS分析数据的PCA得分图(A、B)和OPLS-DA得分图(C、D、E、F)

3.3 差异代谢物的筛选与鉴定 对SFAE低剂量组和对照组、SFAE高剂量组和对照组的LC-MS数据进行OPLS-DA分析，分别计算各差异变量的VIP值。经筛选鉴定，对照组与给药组比较，共有15个差异有统计学意义的代谢物，其中6个正离子模式差异性代谢物和9个负离子模式差异性代谢物，见表2。对筛选鉴定的显著差异性代谢物，借助代谢组学综合处理软件Metaboanalyst 3.0结合HMDB、KEGG、Lipidmaps等数据库，分析其参与的生理生化过程，主要涉及以下代谢通路：能量代谢、胆汁酸代谢和氨基酸代谢，见表2。

4 讨论

三羧酸循环是需氧生物体普遍存在的能量代谢过程[12]，它既是氨基酸、糖类和脂类的最终代谢通路，又是这三大营养素代谢联系的枢纽。琥珀酸、柠檬酸和酮戊二酸均为三羧酸循环的重要中间产物，大鼠给予苦参后，尿液中琥珀酸和柠檬酸的表达水平显著升高，酮戊二酸的表达水平降低，提示SFAE影响三羧酸循环的能量产生过程。

肝脏是氨基酸代谢的主要场所，任何肝脏损伤都可能导致氨基酸代谢紊乱，脯氨酸和甘氨酸在尿中的水平明显升高，提示SFAE干扰氨基酸代谢通路。胆汁酸是胆固醇的代谢产物，主要分为初级胆汁酸和次级胆汁酸，初级胆汁酸在肝内以胆固醇为原料而生成，又在肠道中合成一系列次级胆汁酸[13]，其水平变化会直接影响胆汁池的动态平衡，从而诱发胆汁淤积和肝脏损伤，研究表明胆汁酸内稳态失衡是许多药物引起肝脏损伤共同的过程[14]，胆酸、甘氨胆酸和脱氧胆酸在尿中水平明显升高，提示SFAE干扰胆汁酸代谢。

表2 SFAE给药组和对照组大鼠尿液差异性代谢物的鉴定结果

注：升高或者降低表示与对照组相比的代谢物变化水平

马尿酸通常是芳香类化合物摄入体内后，在肝脏通过与氨基酸(如甘氨酸)反应转化而成[15]，其表达水平升高提示给药组大鼠肝脏可能受到损伤。N6,N6,N6-三甲基-L-赖氨酸是赖氨酸的甲基化衍生物，是左旋肉毒碱和脂肪酸氧化辅酶的前体物质[16]，与左旋肉毒碱的合成有关，N6,N6,N6-三甲基-L-赖氨酸在尿液中的水平升高提示肉毒碱合成和脂肪酸氧化辅酶的原料增加，可能是机体增加肉毒碱合成的代偿机制。焦谷氨酸是谷氨酸的环化衍生物，与谷胱甘肽代谢有关，尿中焦谷氨酸水平升高提示谷胱甘肽的消耗增加。肌酸是氨基酸的衍生物，主要利用精氨酸、甘氨酸和蛋氨酸在肝内合成，能够为肌肉和神经细胞提供能量。研究表明肝脏损伤时肌酸水平会显著升高[17]。给药组大鼠尿液中肌酸水平明显高于对照组，说明SFAE造成了肝脏毒性。

综上所述，本研究采用UPLC-HRMS技术对灌胃给予SFAE 14 d后的大鼠尿液进行代谢组学研究。运用PCA和OPLS-DA等模式识别方法进行分析，共筛选和鉴定出15个主要的差异代谢物，相关代谢通路分析结果表明SFAE主要影响肝脏的三羧酸循环、胆汁酸代谢和氨基酸代谢等代谢过程。本研究为深入探讨SFAE的肝毒性机制奠定了一定的实验基础。