可见分光光度法测定不同产地黄精中总氨基酸含量

方乐霞，郭宣宣，张 玲，曹 富，朱丽丽

(安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012)

中药黄精为滇黄精(PolygonatumKingianumColl.et Hemsl.)、黄精(P.sibiricumRed.)或多花黄精(P.cyrtonemaHua)的干燥根茎，具有补气养阴、健脾、润肺、益肾之功效[1]。其中多花黄精和黄精为黄精药材的主要来源。黄精属于“药食同源”的植物，不仅是常用的补益药，也是一味重要的食疗药物。现代研究表明，黄精含有多糖、皂苷、醌类、微量元素和多种对人体有用的氨基酸等成分，具有延缓衰老、降低血糖、免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗抑郁、改善记忆功能和防止阿尔茨海默病等作用[2-13]。其中氨基酸是黄精补益强壮作用和增强免疫功能的物质基础之一，对维持生命活动有着非常重要的作用[14]。目前，黄精中氨基酸含量测定方法主要为采用柱前衍生高效液相色谱法及采用氨基酸自动分析仪对黄精中单一氨基酸含量进行测定[15-16]，尚未见关于黄精中总氨基酸含量测定的报道。笔者于2017年5月收集北京怀柔、安徽滁州、贵州贵阳、福建南平等19个产地的黄精新鲜根茎，采用2015年版《中华人民共和国药典》“黄精”项下规定的加工方法加工成药材，建立可见分光光度法测定不同产地黄精中总氨基酸含量，为黄精的综合利用提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 756MC紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；BP211D电子天平(十万分之一)：德国赛多利斯公司；KQ-250DB型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；FW80高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 材料 L-精氨酸对照品(批号160821，纯度≥98%)：成都普菲德生物技术有限公司；茚三酮：天津市光复科技发展有限公司；乙醇：上海润捷化学试剂有限公司；磷酸等均为分析纯：上海润捷化学试剂有限公司；水为高纯水。所有黄精样品经安徽中医药大学王德群教授鉴定为黄精(PolygonatumsibiricumRed.)或多花黄精(P.cyrtonemaHua)的干燥根茎。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 精密称取L-精氨酸对照品3.28 mg，置25 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，配成浓度为0.131 2 mg/mL的对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备 精密称取样品粉末(过三号筛)0.2 g，加入60%乙醇30 mL，超声提取2次，每次45 min，滤过，合并滤液，减压旋至无醇味，浸膏用水溶解，定容至50 mL。

2.3 测定波长的选择 分别精密吸取L-精氨酸对照品溶液、供试品溶液各1.0 mL，置50 mL量瓶中，加茚三酮溶液1.0 mL(称取茚三酮1.0 g加乙醇使溶解成50 mL，冷藏备用)和磷酸盐缓冲液(pH为6.8)1.0 mL，摇匀，水浴加热20 min，取出，冷却，用水定容至刻度。以相应试剂为空白，在400～800 nm波长范围内进行扫描，对照品溶液和供试品溶液在568 nm处均有最大吸收，因此，选择测定波长为568 nm。结果见图1。

注：1.对照品；2.供试品

2.4 显色条件的考察

2.4.1 缓冲盐溶液pH值考察 精密移取供试品溶液1.0 mL于50 mL量瓶中，加入pH值分别为5.2、6.0、6.8、7.6的磷酸盐缓冲溶液2.0 mL和2%茚三酮溶液1.0 mL，摇匀，水浴加热15 min，取出，冷却，加水定容至50 mL。以相应试剂为空白，于568 nm处测定吸光度(absorbance, A)。结果显示使用pH值为6.8的磷酸缓冲盐溶液所测得的吸光度最高。因此选择缓冲盐溶液pH值为6.8。

2.4.2 缓冲盐溶液用量的考察 精密移取供试品溶液1.0 mL置50 mL量瓶中，分别加入pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液0.3、0.5、1.0、2.0、3.0 mL，各加入2.0%茚三酮溶液1.0 mL，摇匀，水浴加热15 min，取出，冷却，加水定容至50 mL，测定A值。结果显示磷酸盐缓冲溶液用量为1.0 mL时吸光度最高。因此选择磷酸盐缓冲溶液用量为1.0 mL。

2.4.3 显色剂用量的考察 精密移取供试品溶液1.0 mL置50 mL量瓶中，加入pH值为6.8的缓冲盐溶液1.0 mL，分别加入2.0%茚三酮溶液0.5、1.0、1.5 mL，摇匀，水浴加热15 min，取出，冷却，加水定容至50 mL，测定A值。结果显示当显色剂用量为1.0 mL时，吸光度最高。故选择显色剂用量为1.0 mL。

2.4.4 显色时间的考察 精密量取1.0 mL供试液液于量瓶中，加入pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液1.0 mL、2%茚三酮溶液1.0 mL，摇匀，于沸水浴中分别加热5、10、15、20、25 min，取出，冷却，加水定容至50 mL，测定A值。结果显示加热时间为20 min时，A值最高，因此选择显色时间为20 min。

2.5 提取条件的考察

2.5.1 提取方式的考察 精密称取样品4份，每份约0.2 g，分别采用超声提取、回流提取，滤过，合并滤液，浓缩回收乙醇，浸膏加水溶解，定容至50 mL。精密移取供试品溶液1.0 mL于50 mL量瓶中，以“2.3”项下方法显色，测定A值。结果显示超声提取效果优于回流提取。

2.5.2 提取时间的考察 精密称取样品3份，每份约0.2 g，采用超声提取，超声提取时间分别为30、45、60 min，按“2.5.1”项下自“滤过”起，依法操作，结果显示提取45 min时A值最大。因此，选择提取时间为45 min。

2.5.3 提取次数的考察 精密称取样品0.2 g，加60%乙醇30 mL超声提取，提取次数分别为1、2、3次，按“2.5.1”项下自“滤过”起，依法操作，结果表明提取2次和3次时A值相近，为节约时间及能源，选择提取次数为2次。

2.5.4 提取溶剂浓度的考察 精密称取样品4份，每份约0.2 g，分别加50%、55%、60%、70%乙醇30 mL，超声提取2次，每次45 min，按“2.5.1”项下自“滤过”起，依法操作，结果显示溶剂浓度为60%时A值最大。因此，选用60%的乙醇作为提取溶剂。

2.5.5 料液比考察 精密称取样品5份，每份约0.2 g，分别按料液比1∶50、1∶100、1∶150、1∶200、1∶250加入60%乙醇进行超声提取两次，每次45 min。按“2.5.1”项下自“滤过”起，依法操作，结果表明料液比选取1∶150为佳。

2.6 方法学考察

2.6.1 标准曲线的绘制 精密吸取L-精氨酸对照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，分别加2%茚三酮溶液1.0 mL和磷酸盐缓冲液1.0 mL，水浴加热20 min，取出，冷却，用水定容至25 mL。以相应试剂为空白，在568 nm处测定A值，以对照品溶液浓度(μg/mL)为横坐标，A值为纵坐标，得回归方程为A=0.084 3c-0.154 8(r=0.997 5)。表明L-精氨酸在3.248～18.368 μg/mL浓度范围内与A值呈良好的线性关系。

2.6.2 精密度试验 精密移取供试品溶液1.0 mL，按“2.3”项下同法显色，以相应试剂为空白，于568 nm处测定A值，重复测定6次，RSD=0.14%，结果表明该方法精密度良好。

2.6.3 重复性试验 取同一批次药材，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，精密移取供试品溶液1.0 mL，按“2.3”项下同法显色，测定A值，结果显示总氨基酸含量RSD=0.20%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.6.4 稳定性试验 精密移取供试品溶液1.0 mL，按“2.3”项下同法显色，分别于0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 h时测定A值，RSD=0.31%，结果表明该显色反应在3 h内稳定。

2.6.5 加样回收率试验 精密称取已知含量的黄精粉末0.1 g，平行9份，按1∶1.5、1∶1、1∶0.5分别加入精氨酸对照品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，精密移取供试品溶液1.0 mL，按“2.3”项下同法显色，在568 nm测定A值，计算加样回收率，结果见表1。样品平均加样回收率为98.72%，RSD为1.26%，表明本法测定结果准确可靠。

表1 加样回收率试验

2.7 不同产地黄精中总氨基酸含量测定 取不同产地的黄精药材，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，精密移取供试品溶液1.0 mL，并按“2.3”项下方法显色，在568 nm测定吸光度，样品含量测定结果见表2。

3 讨论

3.1 试验条件讨论

3.1.1 显色条件考察结果 分别对不同磷酸缓冲液pH值、磷酸盐缓冲液用量、显色剂用量、显色时间进行考察，最终确定黄精中总氨基酸含量测定的最佳显色条件为：加入pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液1.0 mL，2%茚三酮溶液1.0 mL，摇匀，于沸水浴中加热20 min。

3.1.2 提取条件考察结果 分别考察了提取方式(超声提取，回流提取)、不同提取时间、提取次数、提取溶剂浓度、料液比。确定用于黄精中总氨基酸含量测定的供试品溶液的最佳提取工艺为：取黄精粉末0.2 g，精密称定，加入60%乙醇30 mL，超声提取2次，每次45 min。

表2 黄精样品来源和总氨基酸含量

3.2 实验结果讨论

3.2.1 多花黄精中总氨基酸含量与黄精中总氨基酸含量结果分析 5个产地黄精总氨基酸含量范围在5.79%～9.93%，平均值为7.83%。如以-20%为下限，建议黄精总氨基酸含量应不低于6.26%。5个产地的黄精基本达到该含量。14个产地多花黄精总氨基酸含量范围在2.94%～6.97%，平均值为5.10%。由于产地不同，各品种的多花黄精中总氨基酸含量有所差异。如以-20%为下限，建议多花黄精总氨基酸含量应不低于4.08%。含量结果显示黄精中总氨基酸含量明显高于多花黄精。

3.2.2 不同产地多花黄精中总氨基酸含量比较 14个产地多花黄精总氨基酸含量在其分布的东、西、北缘较高；从四川盆地到浙、闽丘陵到贵州、湖南山区，总氨基酸含量呈增大趋势。贵州遵义、江西抚州、福建南平、湖南岳阳多花黄精总氨基酸含量较高，因其经度相似，均属于亚热带温润季风区，降水丰富，利于氨基酸成分的积累。金寨(叶背面有毛型)、金寨(叶梗长型)、浙江杭州、四川资阳含量较低。安徽青阳多花黄精总氨基酸含量明显高于安徽金寨，因青阳既有亚热带湿润季风气候的总体特征，又有受山区海拔高度、地形地势影响而形成的阴、凉、湿的山区气候特点。四川资阳多花黄精总氨基酸含量最低，可能是由于其处于盆地，常年有雾，日照不足，不利于氨基酸成分的积累。

3.2.3 不同产地黄精中总氨基酸含量比较 黄精产地分布与总氨基酸含量呈现出由西向东逐渐下降的趋势。陕西商洛由于受到冬夏季风和青藏高原环流的影响，加之秦岭整个山脉对南方暖湿气流的阻挡作用，造成其四季分明，雨热同期的气候特点，这可能是造成商洛黄精中氨基酸含量较高的原因。

本研究采用可见分光光度法建立了黄精中总氨基酸含量的测定方法，该方法操作简便、快速，结果准确，可作为黄精中总氨基酸含量的测定方法。本研究对黄精中总氨基酸含量进行测定，对于黄精的综合利用具有一定的意义。

(在样品的收集过程中得到安徽森沣综合开发有限公司的帮助，样品的加工得到安徽中医药大学2015级研究生彭星星、刘校的帮助，在此表示感谢！)