丹参治疗股骨头坏死的分子机制研究

阎博昭，李 刚，许 波，李嘉程，夏聪敏，梁学振，骆 帝

(1.山东中医药大学，山东 济南 250355；2.山东中医药大学附属医院骨科，山东 济南 250355)

股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)病程长、致残率高且临床常见。相关资料显示，目前中国ONFH患者例数为500万～750万，每年新增患者7万～15万[1]。各类原因导致的股骨头血液供应不足、骨细胞损害造成的骨坏死是当前ONFH发病的主流认知[2-3]。本病早期若不能及时进行药物干预，将会导致股骨头结构改变甚至塌陷等严重后果，大大降低患者的生活质量。目前，治疗ONFH的公认药物主要包括双膦酸盐类药物、降脂类药物、抗凝药物、血管扩张药物、参与氧化应激类药物、参与骨代谢药物等[4]。上述药物虽然可以改善临床症状，但存在靶向性单一、疗效不确切等问题，而中医药凭借其辨证论治而达到精准治疗的优势便凸显出来了。

在运用中医药防治股骨头坏死的长期临床观察基础之上，笔者发现“瘀”和“虚”两大要素始终贯穿该病始末，“瘀”即血瘀痰阻、经络阻滞；而“虚”即肝肾亏虚、气血不足。“虚”为本而“瘀”为标，本虚标实之证是为该病的病机，因此，运用“补肾活血”为思路，以丹参为主遣方用药，可获显著疗效。一味丹参，功同四物，其水溶性成分和脂溶性成分是其重要活性成分[5]。丹参具有增进组织修复与再生、加速骨质形成、抗血栓、调节微循环、抗氧化以及镇静镇痛等作用[6]。但现有研究未就其分子机制作出清晰的阐释，需要利用科学的方法加以研究和阐述。因此，我们利用网络药理学手段，通过筛选和预测丹参和ONFH中符合要求已公开报道的相关靶点，并对靶点富集分析得出信号通路，以探讨丹参可能的分子机制。见图1。

1 方法

1.1 丹参药物成分筛选及成分网络构建 通过中药系统药理学数据库和分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP；http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)[7]进行丹参药物成分挖掘。并根据成分药物代谢动力学(absorption and distribution and metabolism and excretion, ADME)[8-10]参数进行选择，其标准[11-12]为：药物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，类药性(drug-likeness，DL)≥0.18。通过TCMSP靶点预测模型预测上述入血活性成分的作用靶点，基于网络图像化软件Cytoscape 3.2.1(http：//www.cytoscape.org)[13]对活性成分及作用靶点生成网络构建，并分析网络特点，得到丹参中重要成分靶点。

图1 丹参治疗股骨头坏死的分子机制分析流程图

1.2 检索已知的ONFH相关疾病靶点 检索药物银行(DrugBank；https://www.drugbank.ca)、药物遗传学和药物基因组学知识库(pharmacogenetics and pharmacogenomics knowledge base，PharmGKB；https://www.pharmgkb.org)、人类表型数据库(the human phenotype ontology，HPO；http://human-phenotype-ontology.github.io)、遗传关联数据库(the genetic association database，GAD；https://geneticassociationdb.nih.gov)、在线人类孟德尔遗传数据库(online mendelian inheritance in man，OMIM；http://www.omim.org)、疾病-基因网络集合数据库(disease-gene net，DisGeNET；http://www.disgenet.org)、治疗靶点数据库(therapeutic target database，TTD；http://bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp)等与疾病靶点相关的数据库，筛选后获得目前已知的ONFH发病相关靶点。

1.3 蛋白质-蛋白质相互关系网络构建和关键靶点筛选 为了直观地呈现药物有效成分和靶点之间的调控关系，利用Cytoscape软件中的BisoGenet插件对上述获得的丹参入血活性成分及ONFH靶点进行蛋白质-蛋白质相互作用关系(protein-protein interaction, PPI)网络绘制，而BisoGenet是由生物数据交互库(biological general repository for interaction datasets，BioGRID；https://thebiogrid.org/)、生物分子相互作用网络数据库(biomolecular interaction network database，BIND；https://www.isc.org/downloads/bind/)、分子相互作用数据库(molecular interaction database，MINT；http://cbm.bio.uniroma2.it/mint/index.html)、人类蛋白质参考数据库(human protein reference database，HPRD；http://www.hprd.org)、相互作用蛋白数据库(database of interacting proteins，DIP；http://dip.doe-mbi.ucla.edu/dip/Main.cgi)和开源分子相互作用数据库(IntAct数据库；https://www.ebi.ac.uk/intact)共6个不同的蛋白质相互作用关系数据库构成的数据库工具。随后将2个网络图融合并抽取交集网络，即可得到丹参治疗ONFH的直接和间接靶点调控网络图。

通过网络拓扑分析插件CytoNCA (http://apps.cytoscape.org/apps/cytonca)[14]对上述操作所得交集网络进行拓扑分析，进一步呈现所构建网络中的关键靶点。筛选标准借助以下指标：度中心性(degree centrality，DC)、介度中心性(betweenness centrality，BC)、接近中心性(closeness centrality，CC)，特征向量中心性(eigenvector centrality，EC)、网络中心性(network centrality，NC)和局部边连通性(local average connectivity，LAC)等。

1.4 信号通路富集分析 上述步骤取得关键靶点后，以通路富集分析插件ClueGO(http://www.ici.upmc.fr/cluego/cluegoDownload.shtml)[15]进行信号通路富集分析，可视化展现结果并绘制信号通路占比饼状图。通过结果进一步分析丹参治疗ONFH的可能作用机制。

2 结果

2.1 丹参活性成分筛选与ADME分析 本研究通过TCMSP数据库共检索到丹参已被报道的所有成分202个，根据OB和DL等ADME参数筛选到入血活性成分65个，其筛选的成分分布图见图2。

注：OB为药物口服生物利用度，DL为类药性

图2根据ADME参数筛选出的丹参入血活性成分分布图

2.2 丹参作用靶点预测及“活性成分-靶点网络”构建分析 本研究利用TCMSP靶点预测模型预测技术对上述活性成分进行作用靶点预测，排除重复靶点，共获得预测靶点103个；利用网络图形化工具Cytoscape 3.2.1对上述入血活性成分及预测的作用靶点进行关系网络的绘制和分析可知，丹参发挥重要作用的入血活性成分与对应的作用靶点的相互关系共1 348个，如图3所示。

2.3 ONFH相关靶点检索分析 本研究通过检索目前国际公认的7个疾病基因相关数据库，并搜集前期研究和报道，共获得与ONFH发生、发展密切相关的已知的相关靶点基因74个，其中TTD、DrugBank、OMIM、GAD、PharmGKB、DisGeNET、HPO数据库分别检索到0、0、3、46、34、14、1个靶点。

2.4 丹参治疗ONFH的PPI网络构建与关键靶点筛选分析

2.4.1 丹参治疗ONFH的PPI网络构建分析 本研究通过BisoGenet对丹参入血活性成分的作用靶点进行PPI网络构建，发现与其产生直接或间接作用的靶点共有5 896个，而这些靶点与靶点之间的相互关系多达131 478个。与此同时，对ONFH相关的靶点绘制PPI网络图，发现与其直接或者间接相关的靶点多达2 002个，靶点与靶点相互关系有51 792个。

2.4.2 丹参治疗ONFH的关键靶点筛选分析 本研究通过Cytoscape 3.2.1对上述绘制的2个PPI网络图抽取交集网络，同时采用CytoNCA工具(https://omictools.com/cytonca-tool)根据网络节点的拓扑属性筛选，共发现关键节点130个。筛选策略示意图见图4。

2.5 丹参治疗ONFH的机制分析 本研究利用ClueGO对上述130个关键节点进行富集分析，结果显示，丹参作用于ONFH的关键节点主要涉及75条信号通路，例如促进成骨细胞的骨形成和抑制破骨细胞的骨吸收信号通路，见图5。

3 讨论

ONFH病情迁延难愈，致残率高，最终骨组织结构遭到不同程度的破坏，下肢力学性能发生改变。西医认为ONFH的发病机制是脂类代谢紊乱、骨内高压、血管内凝血、二次碰撞等[16]。而中医学则认为，ONFH的病机是外邪侵袭，痹组经络，气血运行不畅，加之先天肾气不足，正虚邪恋[17]。《宣明论方》曾指出：“夫痛者，经脉流行不止，环周不休，寒气入经而稽迟，血泣凝而不行，客于脉外血少；客于脉中气不通，故卒然而痛。”因此，“气滞血瘀，脉络瘀阻”是导致患肢疼痛的关键因素之一。本课题组在临床根据该病的辨证分期，以“补肾活血”为治疗思路，遣方用药中活血药不离始终，均取得满意的效果[18-19]。

注：图中菱形代表丹参最终入血活性成分；圆形分别代表靶点基因名；连线代表丹参入血活性成分与对应的作用靶点的相互关系

图3丹参“活性成分-靶点”网络图

注：图中nodes代表靶点；edges代表靶点间相互关系；箭头代表拓扑筛选的步骤。DC(degree centrality)：借助度中心性；BC(betweenness centrality)：介度中心性；CC(closeness centrality)：接近中心性；EC(eigenvector centrality)：特征向量中心性；NC(network centrality)：网络中心性；LAC(local average connectivity)：局部边连通性

图4丹参关键节点的目标筛选策略图

注：A.ClueGO信号通路显著富集网络图；B.ClueGO富集分析饼状图

丹参作为临床经典的活血化瘀中药，走血分而通血脉。《神农本草经》首载，味苦，微寒，归心、肝经，具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦的功效[20]。胡海等[21]通过文献挖掘并筛选发现活血化瘀药和补虚药是中医药治疗ONFH的两大类常用药，而丹参在活血化瘀药中的出现频率为50.6%，可见其重要性。其治疗股骨头坏死的疗效已被大量实验研究及临床研究证实。瓦庆德等[22]通过复制激素性股骨头坏死动物模型，观察兔破骨细胞数量，发现丹参骨髓腔内注射可抑制破骨细胞生成，对早期激素性股骨头缺血性坏死有预防作用。李晓明等[23]通过临床观察发现丹参的有效成分之一丹参酮ⅡA可以改善股骨头缺血区组织的侧支循环，纠正缺血组织的代谢紊乱，有利于骨组织再生。本研究通过筛选获得丹参中入血的活性成分65个，并在此基础上挖掘出103个可能的靶点和1 348个相互关系。“活性成分-靶点”网络分析显示，丹酚酸、鼠尾酮、次丹参酮、毛地黄黄酮、黄芩苷等有效成分能作用于网络中多个靶点，MMP2、NCOA2、IL2等靶点也能与多个成分形成作用关系。由此可知，丹参药物的各个有效成分与其作用靶点对疾病的进展起着至关重要的作用。

从通路富集结果分析可知，丹参主要通过影响Wnt、NF-κB、HIF-1、MAPK、Notch、PI3K-Akt等多条与ONFH密切相关的信号通路而发挥其治疗作用[24]，而这些关键通路可以分为两大类：促进成骨细胞的骨形成作用与抑制破骨细胞的骨吸收作用。①促进成骨细胞的骨形成作用相关通路。Wnt信号通路可以调控骨细胞增殖分化，促进成骨，抑制成脂[25]。Shi等[26]在MC3T3-E1骨祖细胞系增殖分化的不同阶段进行干预，证实Wnt通路组分表达与成骨细胞的分化呈正相关。MAPK信号通路调节特定的基因表达而参与细胞生理过程，在成骨细胞的增殖、分化、凋亡中参与信号转导[27]。丁道芳等[28]通过观察MAPK-ERK1/2信号通路的激活或抑制对大鼠成骨细胞的影响，发现此通路与成骨细胞增殖与基因表达显著相关。HIF-1信号通路能够适应机体缺氧环境，调控骨形成及血管生成。邹多宏等[29]通过基因工程技术试验证明HIF1ɑ能够明显上调骨髓间充质干细胞的成骨与成血管因子的表达。②抑制破骨细胞的骨吸收作用相关通路。NF-κB信号通路是大多数生物活性物质介导骨吸收的最终和共有通路。NF-κB受体活化因子配基直接影响破骨细胞的分化及功能[30]。Notch信号通路通过上调Jagged1和Notch2可抑制骨髓细胞向破骨细胞诱导分化[31]。有研究表明，PI3K/Akt通路参与调控抑制破骨细胞生成[32]。

综上，丹参通过多种关键信号通路影响成骨细胞与破骨细胞的细胞生理过程，进而达到防治ONFH的作用。此外，丹参作用靶点富集分析结果还显示，网络集群中还覆盖了炎症、免疫、DNA复制、泛素介导的蛋白水解、EB病毒感染等相关信号通路，各靶点及信号通路之间存在较为复杂的相互关系，也揭示了中药多成分多靶点的作用特点。

本研究基于网络药理学相关理论和技术，旨在揭示活血中药丹参治疗ONFH的可能作用机制，为后续实验研究指明方向。随着研究技术及理论水平的不断发展，中药及其复方治疗ONFH的分子机制将会得到进一步阐明，中医中药必将会在诸如ONFH等难治性骨病中发挥不可替代的作用。