狼疮方调节肾小球系膜细胞趋化因子表达的研究*

★ 王莹 杨小军 杨军平（江西中医药大学附属医院 南昌 330006）

现代医学认为，自身免疫性疾病形成的免疫复合物，沉积在肾小球，促进肾组织细胞活化，引起大量细胞因子产生，导致免疫细胞功能异常，是公认的狼疮性肾炎（LN）产生的病理原因，是LN发病进程的主要机制［1-2］。系统性红斑狼疮（SLE）引起肾损害的病理变化部位主要在肾小球系膜区，具有趋化作用的细胞因子在肾小球球硬化的发展过程中扮演着重要的角色，发挥着至关重要的作用。中医认为狼疮性肾炎先天禀赋不足，肝肾亏虚，或七情内伤，郁久化热，阴阳失调，经脉痹阻，营卫不和，卫外不固，脏腑亏损而成；或因暴晒日光，内外结合，两热相搏，导致气血逆乱；或房事不节，伤及肾精，外感毒邪，复感湿邪之毒侵袭；或服食毒热之品，导致致气血不畅，阻滞经络血脉，邪毒久稽，伤阴血，浸淫筋骨脏腑，损害肾脏而致。在临床实践中，根据解毒活血法组成的狼疮方是叶任高教授SLE病证结合治疗方案中专用的中药复方，其临床疗效得到广泛认可［3］。以叶任高狼疮方为基本方，药用全蝎、乌梢蛇、白花蛇舌草、紫草根、半枝莲、野菊花等，调和诸药，共奏滋因扶正，清热解毒之功。HMC所表达的趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11，通过中药干预的信号传导通路如何，以及调节的机制尚不清楚。故本课题以HMC为研究对象，探讨中药作用在HMC表达趋化因子的状况，并进一步探讨其具体机制，为中药治疗SLE提供可能的实验理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 RPMI1640培养基（北京索莱宝公司）；胰蛋白酶（美国sigma）；胎牛血清 （美国Gibco）；重组人IFN-Y（美国Peprotech公司）；R-T PCR检测试剂盒（ 上海Promega公司）；CXCL9/10/11上、下游引物（上海英潍捷基）；人CXCL9/10/11 酶联免疫试剂盒（上海西塘公司）；酶标仪（美国BIOTEK公司）；实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）；梯度PCR仪（美国ABI公司）。狼疮方由全蝎、乌梢蛇、白花蛇舌草、紫草根、半枝莲、野菊花等中药组成，常规水煎，分别浓缩成含生药量0.3g/mL、0.6g/mL、1.2g/mL三种剂量，4℃冰箱保存备用。

1.2 Real-Time PCR检测趋化因子mRNA的相对表达量 人肾小球系膜细胞（中南大学细胞库）用含10%的胎牛血清1640培养液，在37℃、置5%CO2细胞培养箱中培养，每2d换液1次。依据作用于HMC的不同，分成5组：空白对照组：无任何药物刺激，只加入完全培养液；刺激组：加入1000U/mL的IFN-Y刺激诱导HMC30min；中药低剂量组加入含生药量0.3g/mL中药狼疮方含培养液100μL预处理40min，再加入1000U/mLIFN-Y刺激诱导细胞30min。中药中剂量组加入含生药量0.6g/mL中药狼疮方含培养液100μL预处理40min，再加入1000U/mL IFN-Y刺激诱导细胞30min。中药高剂量组加入含生药量1.2g/mL中药狼疮方含培养液100μL预处理40min，再加入1000U/mL IFN-Y刺激诱导细胞30min。HMC经过提取总RNA，分析总RNA的浓度及纯度，达到纯度标准，以GAPDH作为管家基因，CXCL9、CXCL10、CXCL11作为目的基因，引物CXCL9 5'-GAAGCAGCCAAGTCGGTTAGTG-3'、CXCL10 5'-TTAGTGGATGTTCTGACCCTGCTTC-3'、CXCL11 5'-CCATCGGAGTTTACAAAGTGCT-3'、GAPDH 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，依据目的基因CXCL9、CXCL10、CXCL11PCR的反应信号以及管家基因GAPDH的PCR反应信号强度，算出荧光定量CT值，用2-AACT方法，计算样本趋化因子mRNA的相对表达量。AACT计算方法为：AACT=实验组（目的基因CT值-管家基因CT值）-空白组（目的基因CT值-管家基因CT值）。

1.3 ELISA实验检测趋化因子蛋白分泌量 获取5组HMC 细胞培养上清液，细胞培养上清液用细胞离心机12000xg，离心5min，去除沉淀，置于-80℃冷冻冰箱中保存，切勿反复冻融。ELISA检测趋化因子浓度测定，在酶标仪上，450nm处读取吸光值（OD值），根据OD值计算各样品对应的CXCL9、CXCL10、CXCL11浓度，并通过ELISA软件进行分析。

1.4 统计学方法 采用 SPSS10.0统计软件分析数据，各组数据均以平均值±标准差（）表示，实验结果两组比较采用双侧 t 检验，以P＜0.05 作为差异具有显著性的标准。

2 结果

2.1 狼疮方调节IFN-Y介导的HMC的CXCL9mRNA、CXCL10mRNA和CXCL11mRNA的表达 刺激组CXCL9mRNA、CXCL10mRNA、CXCL11mRNA 相 对表达量明显升高，与空白组对比，具有统计学差异（P＜0.01）。给予中药调节后，与刺激组比较，中药各组有不同程度的降低，其中中药中剂量组降低有显著性（P＜0.01）。说明狼疮方可以调节趋化因子的信使RNA的表达。

表1 趋化因子mRNA相对表达量及中药调节（）

表1 趋化因子mRNA相对表达量及中药调节（）

注：与空白组相比*P＜0.01；与刺激组相比#P＜0.01。

组别 CXCL9mRNA CXCL10mRNA CXCL11mRNA空白组 1.00 1.00 1.00刺激组 107.81±10.92*1523.31±105.61*810.12±148.13*中药低剂量组 93.48±14.11 1385.13±99.89 793.55±110.97中药中剂量组 61.73±23.45# 811.36±60.99# 355.71±45.87#中药高剂量组 94.16±13.77 1427.93±100.58 801.39±10.75

2.2 狼疮方调节IFN-Y介导的HMC的CXCL9、CXCL10和CXCL11蛋白分泌量的变化 刺激组趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11蛋白分泌量明显升高，与空白组对比，具有统计学差异（P＜0.01）。给予中药调节后，与刺激组比较，中药各组有不同程度的降低，其中中药中剂量组降低有显著性（P＜0.01）。说明狼疮方可以调节趋化因子的蛋白分泌量的表达。

表2 趋化因子蛋白分泌量（pg/mL）及中药调节（）

表2 趋化因子蛋白分泌量（pg/mL）及中药调节（）

注：与空白组相比*P＜0.01；与刺激组相比#P＜0.01。

组别 CXCL9 CXCL10 CXCL11空白组 4.23±0.45 18.72±3.55 12.70±3.87刺激组 565.24±20.39*14323.78±3657.13 1301.11±38.48*中药低剂量组 499.48±37.38 13996.27±3710.72 1299.45±40.21中药中剂量组 243.39±11.67#8698.47±1796.63# 624.03±48.99#中药高剂量组 501.47±30.72 14012.74±3589.62 1293.81±37.56

3 讨论

趋化因子是小分子分泌蛋白，能激活免疫细胞的活性，介导细胞定向迁移、并参与机体的免疫调节［4-5］，细胞趋化因子 CXCL9、CXCL10、CXCL11激活免疫细胞，并趋化至肾组织，介导Th1细胞、IFN-Y、肿瘤坏死因子（TNF-α）等，促进炎症反应的发生，并进一步加强人肾小球系膜细胞的增殖，加重狼疮性肾炎的病理表现［6］。有学者报道［7］，很多细胞因子如IFN-Y、TNF-α等可诱导CXCL9、CXCL10、CXCL11的表达，但是IFN-Y的诱导效果最明显。我们的课题通过IFN-Y诱导人肾小球系膜细胞上趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11在的表达，并用中药加以干预调节。结果发现：在体外培养的HMC中，加以IFN-Y进行诱导，趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11的表达增高，中药狼疮方可不同程度的调节趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11的表达，与刺激组相比，中药中剂量组的趋化因子的表达显著性下降（P＜0.01）。原因可能为，Th1细胞分泌的细胞因子主要有IL-2、IFN-Y、TNF-α，其中IFN-Y是最为重要的细胞因子，其在狼疮性肾炎中扮演着重要作用，Th1细胞在 CXCL9、CXCL10、CXCL11的趋化作用下，大量的免疫细胞被活化，Th1辅助T细胞募集至肾小球，同时分泌IFN-Y和TNF-α，分泌的IFN-Y 与TNF-α又再次刺激趋化因子的表达，形成了一个放大的正反馈回路，加剧肾小球硬化，使得肾脏损害加重［8-9］，而狼疮方抑制了Th1细胞分泌细胞因子和辅助T细胞的募集，减少IFN-Y的刺激，降低趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11的表达，延缓了肾小球的硬化和肾脏的损害。

我们通过体外培养HMC，检测上清液中趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11 mRNA的表达及其蛋白分泌量水平的变化，加之以中药进行干预，说明中药狼疮方能调节趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11在人肾小球系膜细胞上的表达，抑制趋化因子蛋白的分泌，对评估SLE肾脏损害程度、病情变化状况以及预后具有一定的价值，为中药治疗SLE提供可能的实验理论依据。