金钗石斛多糖对2型糖尿病大鼠心肌组织凋亡相关蛋白的影响

，， ， ，

糖尿病是威胁人们生活的一种代谢性疾病，近年来随着人们饮食结构的改变，糖尿病的发生率逐年升高[1]。有研究显示，目前我国糖尿病病人高达1亿人，已经成为威胁人们健康的一大疾病[2]。糖尿病病人死亡主要是由血糖升高带来的器质性损害，糖尿病心肌病(DCM)即是其中之一，其主要特征为心脏微循环改变，同时伴有心肌细胞代谢紊乱以及心肌结构的改变，严重者可导致病人左心室肥厚，甚至收缩和舒张功能障碍，最终导致病人死亡[3]。近年来大量科研工作者着眼于糖尿病心肌病的治疗，但对于其具体的发病机制依然没有完全阐明，包括氧化应激、炎症反应、血脂和血糖刺激等均有大量的文献报道，而其中心肌细胞凋亡又是上述多种机制的共同结果，而心肌细胞凋亡可能贯穿心肌病的发生以及发展全过程[4-6]。石斛是我国古典药书中一味名贵药材，研究显示，石斛对肠胃、肾脏以及心脏等均有很好的调节作用，金钗石斛多糖是从金钗石斛中提取的多糖类物质[7]，药理活性值得关注。本研究通过高脂高糖饮食构建2型糖尿病大鼠模型，观察经金钗石斛多糖治疗后，心肌改变的特点，为石斛多糖的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 60只雄性清洁级SD大鼠，购于昆明医科大学动物实验部，合格证号为2014-007，体重为200 g±20 g，在购买后饲养于标准实验间，在适应性喂养2周后进行后续动物实验。

1.2 实验材料 洛汀新贝那普利片购于诺华制药；金钗石斛多糖购于云南泰鑫源铁皮石斛有限公司；胰岛素测定试剂盒和血糖测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所；Trizol试剂购于北京天根生物有限公司；RT-PCR试剂盒购于Fermentas Company公司；PCR引物购于上海英俊生物技术有限公司；DAB显色试剂盒，Bcl-2、Bcl-xl、Bax和Bad抗体，对应辣根酶标记的二抗以及SABC试剂盒抗体购于武汉博士德生物工程有限公司；GAPDH抗体购于美国Santa公司。

1.3 实验分组、造模和治疗 所有大鼠随机分为6组，分别为正常对照组、2型糖尿病心肌损伤组(模型组)、金钗石斛多糖低剂量治疗组(低剂量组)、金钗石斛多糖中剂量治疗组(中剂量组)、金钗石斛多糖高剂量治疗组(高剂量组)以及阳性药物贝那普利治疗组(阳性对照组)，每组均为10只。

2型糖尿病大鼠模型构建采用高脂高糖饮食法，其中高脂饲料由昆明医科大学动物实验部配制，主要成分为：67%普通饲料、20%蔗糖、10%猪油、2%胆固醇和1%胆酸钠，10%红糖水，由大鼠自由饮食，6个月后检验是否造模成功，造模成功标准为连续7 d血糖测定值≥15.6 mmol/L。

造模成功后，正常对照组和模型组日常给予生理盐水1 mL/(kg·d)灌胃，金钗石斛多糖低、中和高剂量治疗组分别给予金钗石斛多糖100 mg/(kg·d)、200 mg/(kg·d)及400 mg/(kg·d)灌胃，阳性对照组则给予贝那普利1 mg/(kg·d)灌胃，共灌胃8周。

1.4 标本采集 治疗结束后处死大鼠，处死大鼠前用1%水合氯醛10 mL/kg腹腔麻醉，之后测定大鼠左心室变化特点，测定后采用腹主静脉采血法收集血液，血液收集后立即离心，离心采用低温高速离心机，离心速度为4 000 r/min，离心时间为10 min，10 min后收集上清液置于超低温冰箱中保存以测定血糖和胰岛素含量，采血后处死大鼠，取出心脏，用生理盐水冲洗后取心尖处部分用4%多聚甲醛固定，以备HE染色，其余置于超低温冰箱中用于检测相关凋亡蛋白的表达特点。

1.5 指标学检测

1.5.1 血糖 根据试剂盒说明书提示，血糖测定采用氧化还原法，测定仪器为分光光度计。

1.5.2 血浆胰岛素 根据试剂盒说明书提示，胰岛素的测定方法为酶法(SWT-1)，测定仪器为酶标仪。

1.5.3 Millar导管测左心功能 左心功能的测试采用Millar法测定，测定时暴露大鼠左室心尖部位，之后利用电极探头在心尖处直接行穿刺，测定时由专业医师完成，以控制其可以精确插入左心室，之后对其进行测定，同时使用相关软件分析心血管相关参数：左室舒张末压(LVEDP)、左室收缩压(LVSP)、左室内压最大上升速率(+dp/dtmax)以及左室内压最大下降速率(-dp/dtmax)。测定后记录，导出相关数据即可。

1.5.4 心肌组织苏木素-伊红(HE)染色 心肌组织病理学检测参照文献[8]进行，采用HE染色，简单描述为取材、脱水、石蜡包埋、切片、染色以及观察。

1.5.5 实时荧光定量PCR法 Bcl-2、Bcl-xl、Bax和Bad的检测方法采用实时荧光定量PCR法(RT-qPCR法)。①利用Trial法磨碎心脏组织以提取总RNA；②对提取的RNA进行定量和逆转录；③扩增逆转录的DNA，扩增条件为：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，反复循环次数为40次，最后72 ℃延伸5 min即完成。在数据收集后采用2-ΔΔCT法统计分析相关指标变化特点。引物设计为Bcl-2正向：TGAACCGGCATCTGCACAC，反向：CGTCTTCAGAGACAGCCAGGAG，产物长度：289 bps；Bcl-xl正向：CCCAGAAAGGATACAGCTGG，反向：GCGATCCGACTCACCAATAC，产物长度：448 bps；Bax正向：AGACACCTGAGCTGACCTTGGAG，反向：GTTGAAGTTGCCATCAGCAAACA，产物长度：255 bps；Bad正向：ACCACAAGTCCATGCCATCAC，反向：CCCACACCCTTTTTGGGCA，产物长度：443 bps；GAPDH正向：ACACTGAGCATCTCCCTCAC，反向：GTTGATTGAGCCTGCTTCACC，产物长度：198 bps。

1.5.6 Western blot测定 Bcl-2、Bcl-xl、Bax和Bad蛋白的检测参照文献[9]进行，从低温冰箱中取出心脏组织后称取100 mg后用组织裂解液充分使组织裂解，之后提取上清液，定量调平后每组各取60 mg行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳完成后采用半干转膜法转移至PVDF膜，之后将载有转移蛋白的PVDF膜用5%的脱脂牛奶封闭2 h，2 h后取出，洗涤3次后加入相应1抗，4 ℃过夜后洗膜3次，之后加入对应的二抗孵育2 h，洗涤3次后暗室与ECL发光试剂反应，曝光洗片，扫描，计算各条带的灰度值即完成。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况 大鼠死亡情况统计，正常对照组大鼠无死亡，模型组2只大鼠死亡，金钗石斛多糖低剂量组1只大鼠死亡，中剂量组和高剂量组无死亡，阳性对照组1只大鼠死亡。

大鼠活动情况统计，正常对照组大鼠精神状态良好，行为敏捷，毛色发白有光泽；模型组则有明显的多饮、多食和多尿的特点，较正常对照组明显肥胖，毛色发黄干燥；金钗石斛多糖3个剂量治疗组和阳性对照组大鼠活动情况较模型组明显好转，但和正常对照组比较差异仍较明显。

2.2 各组大鼠血糖和胰岛素含量比较 模型组与正常对照组比较，血糖和胰岛素抵抗指数明显升高(P<0.05)，胰岛素含量明显下降(P<0.05)；金钗石斛多糖低剂量组与模型组比较，血糖和胰岛素抵抗指数差异无统计学意义；而中剂量组、高剂量组和阳性对照组血糖和胰岛素抵抗指数较模型组明显降低(P<0.05)。金钗石斛多糖3个剂量组和阳性对照组胰岛素含量较模型组明显升高(P<0.05)；阳性对照组血糖值明显低于金钗石斛多糖低剂量组(P<0.05)，金钗石斛多糖中、高剂量组和阳性对照组血糖值比较差异无统计学意义。详见表1。

表1 各组大鼠血糖、胰岛素含量以及胰岛素抵抗指数比较(±s)

2.3 各组大鼠心功能指标比较 模型组LVSP、±dp/dtmax较正常对照组明显降低，而LVEDP则明显升高。经金钗石斛多糖以及贝那普利治疗后，较模型组大鼠心肌组织LVSP和±dp/dtmax均明显升高，而LVEDP则明显降低。金钗石斛多糖3个剂量治疗组有明显的剂量依赖性，且金钗石斛多糖中剂量组和阳性对照组疗效基本一致，而金钗石斛多糖高剂量组4个指标改善程度均明显优于阳性对照组。详见表2。

表2 各组大鼠心功能指标比较(±s)

2.4 各组大鼠心肌组织HE染色结果 正常组大鼠心肌纤维排列整齐，没有断裂，同时走形也正常，细胞核呈圆形和椭圆形；而模型组大鼠则有明显的排列紊乱，细胞纤维有明显的断裂，细胞核有不同程度的变性；经金钗石斛多糖及贝那普利治疗后，其心肌细胞变性明显好转。同时低剂量组、中剂量组和高剂量有明显的剂量依赖性，其病理学随着给药剂量的增加而明显增加，此外，低剂量组和阳性对照组基本一致，而中剂量组和高剂量组明显优于阳性对照组。详见图1。

图1 大鼠心脏组织HE染色(20×20)

2.5 实时荧光定量RT-PCR结果 模型组较正常对照组Bcl-2、Bcl-xl明显降低，Bax、Bad明显升高；经金钗石斛多糖和贝那普利治疗后，Bcl-2和Bcl-xl明显升高，而Bax和Bad表达量明显降低(P<0.05)。金钗石斛多糖3个剂量组改善其蛋白表达有明显的剂量依赖性。金钗石斛多糖高剂量组Bcl-2和Bcl-xl明显高于阳性对照组(P<0.05)，Bax及Bad则明显低于阳性对照组(P<0.05)，而低剂量、中剂量组和阳性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见图2。

与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；金钗石斛多糖治疗组与阳性对照组比较，△P<0.05

图2各组大鼠心脏组织中Bcl-2、Bcl-xl、Bax和Bad的mRNA扩增特点

2.6 Western-Blot检测结果 模型组较正常对照组Bcl-2和Bcl-xl明显降低，Bax及Bad含量明显升高。金钗石斛多糖和贝那普利治疗后，Bcl-2和Bcl-xl表达量明显升高，而Bax以及Bad表达量明显降低(P<0.05)。金钗石斛多糖3个剂量组调节上述几个指标有明显的剂量依赖性。金钗石斛多糖高剂量组Bcl-2和Bcl-xl表达明显高于阳性对照组(P<0.05)，而Bax以及Bad表达则明显低于阳性对照组(P<0.05)，而低剂量、中剂量组和阳性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见图3。

与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；金钗石斛多糖治疗组与阳性对照组比较，△P<0.05。

图3各组大鼠心脏组织中Bcl-2、Bcl-xl、Bax和Bad蛋白的相对表达

3 讨 论

糖尿病是威胁我国以及世界人民健康的第三大疾病，随着我国经济文化的发展，人们的物质生活水平逐渐提高，糖尿病的发生率也明显升高[10]。糖尿病本身的危害与血糖升高以及胰岛素分泌不足密切相关，而死因主要为其造成的心、肝、脾、肾等脏器损害，特别是对心血管的损害，一旦发生，给病人带来极大危害[11]。研究发现，由血糖升高带来的胰岛素抵抗指数升高对心肌细胞的毒性是直接刺激的[12]，此外，较高的胰岛素抵抗也可以诱发破坏心肌细胞因子产生，如诱发血管硬化、代谢紊乱等氧化应激，这些病理因子又可反作用于心肌细胞，最终造成心脏损害[13]。糖尿病左心室重塑是糖尿病心脏损害最为常见的一种类型，其病理改变较为复杂，主要病理学表现有心肌肥厚和间质纤维化，病症为心力衰竭及心律失常。

基础医学实验是药物可以被用于临床的关键过程之一，目前对于糖尿病心肌损伤的动物模型，主要有3种方法[14-16]，分别为：转基因或基因沉默大鼠、短期高脂饮食+链脲佐菌素注射以及长期高脂高糖饮食诱导，其中转基因大鼠由于造价高，同时药物治疗死亡率高，而不被广泛采用，因此，短期高脂饮食+链脲佐菌素注射以及长期高脂高糖饮食诱导是最主要的方法，但在实际使用时也有稍许不同，短期高脂饮食+链脲佐菌素注射所形成的大鼠模型，造模时间较短，糖尿病成模率高，但是在造模过程中也存在死亡率较高的问题，此外，由于造模时间较短的问题，心肌损害并不严重，因此其在应用于糖尿病心肌病的研究方面有明显的缺陷，而长期高脂高糖饮食则不同，虽然造模时间较长，造模花费也相对较高，但是其所构建的模型与人体模型特别类似，特别是对脏器的损害属于一个缓慢的过程。因此，本研究采用高脂高糖饮食6个月构建2型糖尿病心肌损害大鼠模型。所有大鼠均造模成功，大鼠具有明显的心肌受损。

石斛主要化学成分为多糖、生物碱、酚类、氨基酸以及挥发油等[17]。已有研究证实，石斛医用价值较高，其可以减慢病人心率，同时拮抗过多的肾上腺素，以及肾脏分泌的5-羟色胺等，进而起到对心脏和肾脏的保护作用，还可以收缩肠系膜血管、降低血黏度、抗自由基损伤等[18-19]。而石斛多糖作为石斛的最主要成分之一，药学价值极高，特别是金钗石斛，主要有七大功效，分别为：①抗肿瘤作用；②具有较强的免疫调节作用；③抗突变作用；④降血压、血脂和血糖作用；⑤抗病毒的作用；⑥抗氧化作用；⑦保护肠胃[20-21]。鉴于文献报道石斛多糖对糖尿病具有很好的调节作用，同时其对抗凋亡也有较好的作用。本研究采用金钗石斛多糖干预糖尿病大鼠，以观察其对心肌是否有保护作用。研究结果显示，金钗石斛多糖不仅对降低血糖具有明显的促进作用，其还可以升高血清胰岛素含量，降低胰岛素抵抗指数，对糖尿病具有很好的辅助治疗作用；此外，其对左心室功能的改善最为明显，效果明显高于临床中目前常用的保护心肌的药物贝那普利。

糖尿病引起心肌损害以及左心室重塑的核心为心肌细胞的凋亡。心肌细胞凋亡贯穿着整个糖尿病心肌病的发展[22]。而细胞凋亡的发生受到多种因子的调控，而在这些调控的蛋白中，Bcl-2原癌基因家族蛋白是研究最为广泛，也是最为重要的一种蛋白，Bcl-2家族蛋白控制细胞凋亡主要通过两条途径实现，途径之一为自身分泌抗凋亡蛋白Bcl-2以及Bcl-xl等，通过分泌这些蛋白起到抵抗细胞凋亡发生的作用，而另一条途径为凋亡促进，其分泌蛋白主要为Bax和Bad等，两条途径互为对立，通过自身的动态平衡来调节凋亡的发生[23-25]。本研究显示，金钗石斛多糖对糖尿病大鼠心肌细胞中Bcl-2和Bcl-xl具有明显的促进分泌作用，降低Bax和Bad的表达，最终有效保护心肌细胞，组织病理学检测也证实其是有效的。

长期高脂高糖饮食构建的2型糖尿病大鼠不仅有血糖升高和胰岛素含量降低，此外其心肌细胞明显受损，凋亡明显加速。金钗石斛多糖则可以降低血糖，升高胰岛素含量，提高左心室功能，进而保护心肌，分析其机制，可能是通过升高Bcl-2和Bcl-xl，降低Bax和Bad表达实现的。