ARB类药物对2K1C型肾血管性高血压大鼠左室重构方面的类效应及作用研究

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目前高血压的治疗，仍以药物治疗为主，非药物治疗为辅[1]。高血压的药物治疗主要有利尿剂、β肾上腺素能受体阻滞剂、钙离子通道阻滞剂(CCB)、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)与血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)受体阻滞剂(ARB)[2]。诸多药物中，临床医生面临着药物的选择问题。自1994 年第一个ARB氯沙坦应用于临床以来，对ARB 的认识也不断提升，ARB 类降压药是一种长效、平稳、强效的降压药，通过选择性阻断AngⅡ与AngⅡ1型受体(AT1R)结合发挥其降压及保护靶器官的作用，在逆转心室重构方面有着积极的作用[3-5]，在心血管疾病的治疗中得到越来越多临床医生的重视。本实验使用4种ARB 类药物(氯沙坦、缬沙坦、替米沙坦、厄贝沙坦)对实验性肾血管性高血压大鼠进行干预，从整体、器官、细胞和分子水平4个层面来对比研究不同ARB类药物对肾血管性高血压大鼠心肌的保护作用，了解ARB 类药物在改善左室重构方面有无类效应，并初步探讨核因子-κB(NF-κB)的表达在高血压左室重构发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验试剂 氯沙坦，杭州默沙东制药有限公司(50 mg)；替米沙坦，上海勃林格殷格翰药业有限公司(80 mg)；厄贝沙坦，杭州赛诺菲安万特民生制药有限公司(150 mg)；缬沙坦，北京诺华制药有限公司(80 mg)；NF-κB兔单克隆抗体，北京博奥森生物技术有限公司；胶原Ⅰ、胶原Ⅲ单克隆抗体，武汉博士德生物工程公司；SP试剂盒，武汉博士德生物工程公司；DAB 显色试剂，武汉博士德生物工程公司；4%多聚甲醛，我院配制。

1.1.2 实验动物 健康雄性SD大鼠56只，体重261 g±12 g，由我院动物实验中心提供。将动物分别放置在16个笼子，每个笼子放4只大鼠，并将其放在标准的实验房进行喂养，温度保持在22 ℃，与此同时给予一定的光照，并进行常规的喂养，饮水自由。

1.2 方法

1.2.1 分组方法 建立高血压动物模型并进行分组处理。56只大鼠随机分为空白对照组(n=8)、假手术组(n=8)及模型组(n=40)，适应性喂养1周后，模型组采用改良的二肾一夹(2K1C)的方法建造肾血管性高血压大鼠模型，模型建立成功后，随机分为4个治疗组(n=8)及1个模型对照(手术)组(n=8)。

1.2.2 模型建立方法 模型以改良的二肾一夹方法建立。4个治疗组及模型对照组给予1%的戊巴比妥钠，然后根据40 mg/kg的含量向大鼠腹腔内部注射进行麻醉处理，等动物完全麻醉以后，即肌肉的张力以及角膜反射等全部消失为止，让大鼠处于仰卧位，固定到手术台上。将其腹部皮肤的毛全部剪掉，并使用碘伏进行消毒、铺巾处理，然后在腹部正中左侧做一个切口，离剑突1 cm左右，切口长度4 cm，将腹腔打开，分离脏器，找到腹主动脉以及腹主静脉的位置，在肾动脉的分支部位使用玻璃分针将肾动脉分离出来，使用4号针头进行穿线结扎，引起肾动脉部位狭窄。经过消毒处理以后，每只肌肉注射青霉素4×104U，持续用药1周。手术完成后，动物置保温箱中进行加热处理，苏醒过后放到普通笼子中，禁食禁水1 d。动物恢复正常排尿以后，才可以正常饮食饮水。假手术组给予1%的戊巴比妥钠按照40 mg/kg麻醉大鼠，待动物麻醉完全后在无菌条件下给予手术，只剥离肾动脉，不结扎，术后给予青霉素4×104U腹腔注射，待动物清醒后，稍微加热些许时间，然后单独放置，禁水禁食24 h，进行观察。手术后4周，每周测量清醒状态下大鼠动脉收缩压，如果其收缩压高于术前30mmHg(1mmHg=0.133 kPa)，并且大于150 mmHg认为造模成功。

1.2.3 干预方法 建模后大鼠药物干预方法：各治疗组按照药品说明书推荐的临床使用剂量分别给予氯沙坦(30 mg/kg)、缬沙坦(30 mg/kg)、替米沙坦(30 mg/kg)、厄贝沙坦(50 mg/kg)灌胃；对假手术组、空白对照组以及模型对照组进行生理盐水灌胃处理，每日1次。

1.3 观察指标 比较各组大鼠心肌组织病理及结构变化，观察血压、心脏指数、左心室指数及NF-κB、Ⅰ型胶原和Ⅲ 型胶原的表达。①每周测量1次清醒安静状态下大鼠尾动脉收缩压。②测定左心室指数及心脏指数：给药8周后，术前禁食12 h，每只大鼠称取体重(BW)后，采用1%的戊巴比妥钠按照40 mg/kg的标准腹腔注射麻醉，解剖后迅速取出心脏，投入4 ℃冰磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，使离体心脏收缩3个或4个心动周期，射出左心室内残余血液，称心脏的重量(HW)，然后沿房室交界处去除左右心房及大血管，去除右心室游离壁，吸水纸吸干残余水分，将左心室进行称重(LVW)，HW/BW表示心脏指数，LVW/BW表示左心室指数。③选取一部分左心室心肌，通过浓度为4%的多聚甲醛进行固定处理，部分心肌组织-70 ℃低温冰箱保存，使用常规的HE法染色处理，在光镜下观察心肌细胞以及间质的变化。④采用SP免疫组化法检测心肌组织中NF-κB、Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原的表达。

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌组织病理及结构变化 空白对照组：心肌纤维走行没有异常并且排列非常整齐，心肌细胞的细胞核为圆形，位于细胞的正中央位置，心肌的间质以及微血管等结构都基本正常。假手术组：心肌排列紧密，纤维组织无增生，血管内皮完好，心肌细胞核呈圆形或椭圆形，居细胞中央。模型对照组：心肌纤维组织增生，心肌扭曲断裂、纤细，细胞萎缩、水肿，心肌细胞灶样坏死，部分心肌纤维消失，淋巴细胞等炎性细胞浸润，纤维细胞增生，黏液样变性，心肌毛细血管增多，管腔狭窄，管壁增厚。氯沙坦组：心肌间质纤维增生，肌纤维排列较紧密，心肌组织部分断裂，心肌纤维变细，血管外可见外膜增生，心肌纤细，少量淋巴细胞浸润。替米沙坦组：可见肌纤维断裂，血管外渗出，小灶样纤维坏死，血管外可见纤维点状增生，内膜下纤维增生，少量淋巴细胞。缬沙坦组：心肌细胞水肿明显，少量纤维细胞增生，血管内膜增生，组织充血，肌纤维排列较稀疏，少量纤维组织变性。厄贝沙坦组：心肌组织充血水肿，血管周围少量纤维化，淋巴细胞浸润，内膜下纤维组织增生，蛋白沉积和肌纤维断裂，排列不齐，心肌组织可见点状缺血坏死，纤维组织增生。详见图1。

图1 心肌组织HE 染色(×200)

2.2 各组大鼠血压、心脏指数、左心室指数比较 模型对照组与空白对照组比较，心脏指数及左心室指数均增高，差异有统计学意义(P<0.05)，提示左心室负荷加重。假手术组与空白对照组比较，血压、心脏指数及左心室指数差异无统计学意义(P>0.05)。假手术组与模型对照组比较，血压、心脏指数及心室指数差异有统计学意义(P<0.05)，说明大鼠血压升高是大鼠肾动脉部分狭窄所致。各治疗组与模型对照组比较，用药8周血压、心脏指数、左心室指数均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。用药8 周后，厄贝沙坦组较其他组血压下降明显，降压效果最好(P<0.05)；氯沙坦组用药后血压高于其他3组，降压效果稍差(P<0.05)；氯沙坦组心脏指数、左心室指数高于厄贝沙坦、替米沙坦、缬沙坦组(P<0.05)。详见表1。

表1 各组血压、心脏指数及左心室指数比较(±s)

2.3 各组大鼠 NF-κB、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达的比较 模型对照组与空白对照组比较，实验结束时NF-κB、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)。假手术组与空白对照组比较，NF-κB、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原差异无统计学意义(P>0.05)。假手术组与模型对照组比较，NF-κB、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。厄贝沙坦组、缬纱坦组、替米沙坦组、氯沙坦组与模型对照组比较，NF-κB、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。4个治疗组用药8 周后组间比较：氯沙坦组NF-κB的表达高于厄贝沙坦组、替米沙坦组以及缬沙坦组(P<0.05)，而厄贝沙坦组、替米沙坦组、缬沙坦组差异无统计学意义(P>0.05)；Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达各用药组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 各组NF-κB、Ⅰ型、Ⅲ型胶原表达比较(±s) ng/mL

3 讨 论

近年来的研究证明，心室重构与高血压病的预后密切相关，而左室肥厚为左室重构的一种表现形式，是一个独立的危险因素[6]。在诸多高血压治疗药物中，降压本身的效果都可以改善由高血压引起的左室负荷过重，进而阻止左室重构的发展。ARB类药物在降压的同时，其自身的药物作用机制本身也可对左室重构起到保护作用。对于高血压发病以及靶器官受损的病人来说，肾素血管紧张素系统具有非常重要的作用。AngⅡ属于该系统中一个非常重要的效应因子[7]。AngⅡ1 型受体属于作用于靶细胞的公共通路，主要是用来进行肾素-血管紧张素系统的级联反应。血管紧张素的血流动力学以及非血流动力学作用有很多，如影响水电解质平衡、提高血压以及对心血管系统产生一定的影响等，这些均被证实为AngⅡ1型受体被AngⅡ激活后的主要效应[8]。AngⅡ1型受体能够对左心室的重构产生很多作用，如能够造成左心室的心肌细胞肥大并且出现间质重塑的现象。根据相关报道，不管是在体内还是体外进行细胞培养，血管紧张素都能够造成小鼠以及成年大鼠或者人的心肌间质出现纤维细胞增殖，并且还会产生大量的胶原蛋白，甚至可以使胶原蛋白的成分发生变化，尤其是增加Ⅰ型胶原蛋白[9]。除此之外，还能够对胶原蛋白的降解产生一定的抑制作用，最终会造成左心室出现僵硬以及舒张功能下降的现象[10]。本研究发现高血压大鼠心脏指数增高，Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原蛋白的表达也明显增高，说明存在左室负荷加重，有左室重构发生的迹象。治疗组大鼠经ARB类药物干预后，心脏指数、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白的表达较模型对照组均明显减少。表明4种ARB类药物对高血压大鼠左室重构均有不同程度的改善。

近年来的研究认为NF-κB在炎症反应过程中起着重要的作用，故推测其可能在高血压病理过程中亦起重要作用[11]。对于很多的炎性细胞因子来说，NF-κB是其共同的通路，在介导各种炎性因子合成的过程中发挥着非常重要的作用[12]。其与炎症细胞因子的相互作用有：NF-κB活化后，可增强肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-1(IL-1)等炎性细胞因子的基因转录，使TNF-α、IL-1、IL-3产生和释放增多，同样，炎性细胞因子也能反过来激活NF-κB的活性，进而使得TNF-α和白细胞介素-1β(IL-1β)再次激活NF-κB；NF-κB活化后还可使白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-8(IL-8)产生和释放增多，导致最初的炎症信号进一步放大。如果血管紧张素和其他受体相结合，就会引起循环中NF-κB被迅速地激活，并且能够对NF-κB产生一定的刺激，使其表达增加，最终造成炎性因子的表达升高，如IL-6、TNF-α等[13]。ARB类药阻断了AngⅡ与受体结合，进而阻断了其引起的炎症细胞因子的表达增加，同时抑制其收缩血管与刺激肾上腺素释放醛固酮作用的机制，达到控制血压、保护心血管系统的作用。本研究显示，NF-κB的表达在各治疗组大鼠的心肌组织中较模型对照组下降，可以推断ARB类药物的作用机制中，其中某一环节对NF-κB起到了抑制作用。NF-κB的表达被抑制减少了炎性细胞因子的合成与分泌，对降低血压同样也起到了一定的作用。

左室重构表现为左心室的负荷加重，进而导致心肌做功增加，初期为代偿性，随着病情的恶化，转为失代偿状态，可引起心肌细胞的肥大，同时还会伴有重量增加以及间质纤维的增生。通过细胞以及分子水平的分析可以得知，大体上可以分为3个环节，分别是细胞外的信号刺激、细胞内的信号转导以及细胞核内部的基因转录活化。本质都是肥大细胞产生刺激信号，并对细胞核内的基因表达产生诱导作用。此外，细胞内的信号转导通路属于细胞外刺激以及细胞核内的基因活化的偶联环节，具有非常重要的作用[14]。本实验中，模型对照组中NF-κB阳性表达明显高于各个治疗组，可以推断ARB类药物抑制了心肌组织中NF-κB的激活，宏观上可以解释为ARB类药物可以作为NF-κB的抑制剂。实验结束后，各个治疗组NF-κB的表达较模型对照组明显降低，大鼠的血压、心脏指数、左心室指数、Ⅰ型胶原、 Ⅲ型胶原含量均低于模型对照组。考虑ARB 类药物改善左心室的重构主要包括以下几方面的内容：①逐渐降低压力负荷以及心肌局部血管紧张素的含量。由于压力负荷的不断下降，能够减轻心肌肥厚，但这不是主要的原因。Rysa[15]研究发现，采用除去血管紧张素以外的肼屈嗪、利血平和氢氯噻嗪的三联降压治疗方法能够降低血压，并且对心肌肥厚减轻的程度要远远小于肾素特异性抑制剂的作用，这说明降压治疗具有一定的意义，但是非压力负荷容易导致心肌肥厚，这一点是必须要注意的；②降低炎症反应。NF-κB 活化后，可增加炎性细胞因子的合成，炎性细胞因子在高血压的发生、发展中起着重要作用，高血压的发生又使得左心室负荷加重，促进左心室重构的发生，环环相扣。由于ARB 类药物可以显著抑制NF-κB 的活性，从而降低炎症因子的表达，最终使得心肌肥厚的程度不断下降。这与Rysa[15]的研究相似，表明ARB类药物对于降低血压以及逆转左心室重构方面有着非常重要的作用。表明对NF-κB 的激活进行干预，很有可能成为治疗高血压心室重构的新靶点。

ARB类药物结构存在很大的差异，可以分为3类。①三苯四咪类：以氯沙坦为代表，是一种前体药物，能够在肝脏中进行逆转，转换成为活性的代谢产物EXP3174，然后可以对血管紧张素的Ⅰ型受体进行选择性阻断并不断地发挥作用。此外，依贝沙坦、坎地沙坦以及他所沙坦也属这类药物；②非三苯四咪喹类：以依普罗沙坦、厄贝沙坦、替米沙坦为代表，本身即为活性物质，不需要生物学转换；③非杂环类：以缬沙坦为代表，不是前体药，能够直接作用于受体并发挥相应的作用。所谓的类效应，至今为止还没有科学的、临床甚至是管理上的定义。因为没有形成一致的结论，目前存在很多的解释。每种药物都有很多的机制，如果这些药物的作用机制相同，就属于同一类药物。从某一角度来说，可以认为ARB类药物可通过降低NF-κB的表达来改善心室重构的过程，虽然功能基团不同，但具有相似的作用机制，故可以认为在此方面具有类效应。本实验推断ARB类药物可以作为NF-κB的抑制剂，心血管疾病如高血压、冠心病、心力衰竭、心肌病等多种常见病，ARB类药物均能起到很好的治疗作用。本实验目的是通过ARB类药物在高血压中的治疗，从逆转心室重构方面的研究入手，探讨4种ARB类药物之间是否存在类效应的作用，并进一步为NF-κB的表达在高血压心室重构发生发展中的作用寻找理论依据。