荸荠皮提取物对土豆脆片焙烤中丙烯酰胺抑制效果的影响

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(1.贺州学院食品科学与工程技术研究院,广西贺州 542899;2.大连工业大学食品学院,辽宁大连 116034)

2002年4月,瑞典研究人员首次在炸薯条、焙烤土豆脆片、面包、谷物、饼干等一些油炸、焙烤的淀粉类食品中检测出丙烯酰胺[1]。丙烯酰胺(Acrylamide)是中等毒性的亲神经毒物,水溶性强,很容易被生物体的消化道、皮肤、肌肉或其他途径吸收,引起急慢性中毒,主要表现为损害神经系统[2-3],是潜在致癌物。近年来,丙烯酰胺的危害倍受人们关注。食品中的丙烯酰胺主要来源于美拉德反应,天冬酰胺和还原糖是其主要前体物质[4],有研究证明,绿茶提取物[5]、竹叶提取物[6]、猕猴桃提取物[7]、油溶性竹叶抗氧化物[8]、水飞蓟素提取物和迷迭香提取物[9]等许多具有良好抗氧化活性的天然植物提取物,对丙烯酰胺的形成均具有良好的抑制作用。

荸荠(Eleocharistuberose),又名马蹄,其果皮含有丰富的酚类、黄酮类等抗氧化活性物质[10-12]。现有研究表明,从荸荠皮乙酸乙酯萃取部位中分离得到金鱼草素[13]、5-甲基金鱼草素[14]、5-异戊烯基金鱼草素[15]、桦木酸[16]、木犀草素[17]、6-甲基木犀草素[18]等多种具有良好抗氧化活性的物质。荸荠皮提取物抗氧化性好,但目前仍未见将其应用于食品加工中抑制丙烯酰胺形成方面的研究。本文考察了荸荠皮70%丙酮总提取物、不同极性萃取液在土豆脆片焙烤中对丙烯酰胺形成抑制效果的影响,并进一步探讨了正丁醇萃取物经大孔树脂分离纯化后的乙醇洗脱液对丙烯酰胺抑制效果的影响,为寻找优良的丙烯酰胺天然抑制剂提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

荸荠皮粉 广西贺州市芳林乡所产荸荠,削皮、晒干、粉碎、过60目筛而得;土豆粉 云南丽江红心土豆,去皮、切片、晒干、打粉、过100目筛,4 ℃下密封冷藏备用;甲醇 优级纯,天津科密欧化学试剂有限公司;丙烯酰胺标准品(纯度≥99.5%)、D101型大孔树脂 天津市光复精细化工研究所;硫酸锌 分析纯,广州化学试剂厂;亚铁氰化钾 分析纯,天津大茂化学试剂厂;丙酮、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚、乙醇 均为分析纯,广东化工试剂工程技术研究开发中心。

R-1020型旋转蒸发仪 郑州长城科工贸;LC-2030C 3D型高效液相色谱仪 日本岛津制作所;TC-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)型C18柱 美国安捷伦;S228-45202-58型DAD检测器 日本岛津;Spec:200 mg/3 mL型固相萃取小柱 广州泛宏;希波式0.45 μm型针筒过滤器 天津富集;LOC-40型离心机 安微中科中佳;PA2004N型电子天平 上海菁海;10、100、1000、5000 μL型移液枪 赛默飞世尔;HBD-5002型电烤箱 珠海家宝德;ULUP-II-40 L型超纯水机 四川优普。

1.2 实验方法

1.2.1 丙烯酰胺标准曲线的绘制 取0.0050 g丙烯酰胺标准品,溶解于50.0 mL含5%甲醇的水溶液,制成100 μg/mL丙烯酰胺标准储备液,再进一步稀释成浓度为10.0、5.0、2.5、1.25、0.625、0.3125 μg/mL的标准溶液,按以下色谱条件进行HPLC测定,以色谱峰面积对浓度作标准曲线,得到线性回归方程:y=63032x-1240.3,决定系数R2=0.9998,线性范围在0～10 μg/mL之间,相关性良好。

色谱柱:反相C18柱;流动相:水∶甲醇(v∶v,95∶5);进样方式:自动进样;进样量:10.0 μL;流速:0.6 mL/min;检测器:DAD检测器;检测波长:210 nm;柱温:30 ℃。

1.2.2 荸荠皮提取物及其稀释液的制备 a. 称取10.0 kg荸荠皮粉,加入提取罐中,用70%丙酮提取(3×40 L),减压浓缩回收丙酮,得荸荠皮70%丙酮总提取物,60 kPa、50 ℃下减压浓缩得0.98 kg干品。b. 将荸荠皮70%丙酮总提取物以1∶5的比例加水悬浮,分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取3次,正丁醇萃取后剩余部分的水层为水萃取物,将上述萃取物以同样方法减压浓缩回收溶剂,分别得石油醚萃取物15.5 g、乙酸乙酯萃取物57.5 g、正丁醇萃取物92.3 g,水萃取物0.71 kg。c. 将正丁醇萃取物完全溶解,用D101大孔树脂分离,依次用25%、55%、95%乙醇进行梯度洗脱,收集洗脱液,同样方法减压浓缩后所得干品,质量分别为15.09、4.58、1.45 g。d. 把前述a、b、c中所得物质分别用超纯水配制成浓度为1.0、1.0×10-1、1.0×10-2、1.0×10-3、1.0×10-5、1.0×10-7、1.0×10-9mg/mL的稀释液,各10.0 mL备用。

1.2.3 土豆脆片样品的制备 预实验结果表明,在160 ℃下焙烤5 min所得土豆脆片的色泽、气味、脆度、韧度和硬度最好,本文按此条件制备土豆脆片样品。

称取烘干至恒重的土豆粉36份,每份2.00 g,分别加入1.1 mL由1.2.2(d)中所配制的各稀释液进行和粉,空白对照组加入等量超纯水进行和粉,称取1.60 g和好的土豆粉,用模具压成厚度为1.0 mm、直径为4.0 cm的薄片,放入烘箱,在160 ℃下焙烤5 min后取出,迅速冷却,制成质量为1.12 g/片的土豆脆片样品。

1.2.4 样品中丙烯酰胺含量的测定 用研钵把1.12 g的土豆脆片研成细粉,移入50 mL离心管中,并用超纯水润洗研钵,总共加入3.5 mL超纯水于离心管中提取丙烯酰胺,再分别加入蛋白质沉淀剂15%亚铁氰化钾溶液和30%硫酸锌溶液各1.0 mL,室温下660 r/min搅拌5 min,再以4000 r/min离心20 min,得上清液2.5 mL。取上清液0.5 mL,过C18固相萃取小柱,用1.5 mL超纯水洗脱,收集洗脱液,过0.45 μm水系针筒式微孔滤膜,按1.2.1的方法测定丙烯酰胺色谱峰面积。每组进行3次平行实验,根据标准曲线,由色谱峰面积计算丙烯酰胺含量,计算公式如下:

样品中丙烯酰胺含量(μg/g)=(C×1.5 mL)×(2.5/0.5)÷1.12 g

式中:C-样品中丙烯酰胺色谱峰面积对应标准曲线中丙烯酰胺的浓度,μg/mL。

丙烯酰胺抑制率(%)=[(AM0-AM)/AM0]×100%

式中:AM0-空白对照组丙烯酰胺含量,μg/g;AM-实验组丙烯酰胺含量,μg/g。

1.3 数据处理

数据处理采用WPS Office 2016进行,作图软件为Origin 7.5。

2 结果与分析

2.1 丙烯酰胺的高效液相色谱图

图1为丙烯酰胺标品在1.2.1条件下测得的高效液相色谱图,图2为同一条件下所测得土豆脆片样品的高效液相色谱图。图1可见,丙烯酰胺标准品的高效液相色谱峰峰形良好,保留时间为8.50 min,对比可见,图2中保留时间8.50 min处可见目标峰,该丙烯酰胺峰峰形良好,与其它杂峰能够很好地分离,可见此样品处理方法和检测条件,适用于土豆脆片中丙烯酰胺含量的检测。

图1 丙烯酰胺标准品高效液相色谱图(1.25 μg/mL)Fig.1 HPLC of standard acrylamide(1.25 μg/mL)

图2 土豆脆片样品中的丙烯酰胺高效液相色谱图Fig.2 HPLC of acrylamide in potato chip samples

2.2 荸荠皮提取物浓度对丙烯酰胺抑制效果的影响

由图3可知,荸荠皮70%丙酮总提取物、不同极性萃取物对土豆脆片焙烤中丙烯酰胺的形成均有抑制作用,但这些添加物浓度与丙烯酰胺含量之间呈非线性关系,这与荔枝原花青素(LPPC)、莲房原花青素(LSPC)和紫麦麸皮提取物等对丙烯酰胺的抑制规律一致[19-20]。由图3、图4看出,在所有荸荠皮提取物中,石油醚萃取物的最佳抑制浓度为1.0×10-7mg/mL,此时达到最大抑制率13.02%,随着浓度的增加丙烯酰胺抑制效果逐渐减弱;荸荠皮70%丙酮总提取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水萃取物等添加物的最佳抑制浓度均为1.0×10-3mg/mL,抑制率分别为11.73%、13.02%、10.81%、17.14%、12.52%,可见抑制效果最好的添加物是正丁醇萃取物,添加物浓度再继续增加时,对丙烯酰胺的抑制效果也逐渐减弱,这一规律与张永菊[20]在天冬酰胺/葡萄糖低湿模拟体系中,研究紫麦麸皮提取物花色苷及其五种花色苷混合物(混合比例1∶1∶1∶1∶1)对丙烯酰胺的抑制作用规律相吻合。此外,石油醚萃取物、70%丙酮总提取物、乙酸乙酯萃取物、水萃取物在高浓度水平1.0×10-1～1.0 mg/mL之间,表现出对丙烯酰胺含量增加的效果,这也与张永菊[20]所指出的锦葵色素-3-葡萄糖苷对丙烯酰胺的抑制作用规律相类似,这其中的原因有待进一步研究。

图3 不同浓度荸荠皮提取物对丙烯酰胺含量的影响Fig.3 The effect of different concentration extracts of Eleocharis tuberose peel on acrylamide content

图4 不同浓度荸荠皮提取物对丙烯酰胺抑制率的影响Fig.4 Comparison of inhibition rates of acrylamide with the different concentration extracts of Eleocharis tuberose peel

2.3 乙醇洗脱液对丙烯酰胺抑制效果的影响

正丁醇萃取物经D101大孔树脂分离纯化后的乙醇梯度洗脱液对丙烯酰胺抑制效果的影响见图5、图6。

图5 不同浓度乙醇洗脱液对丙烯酰胺含量的影响Fig.5 The inhibition effect of diffrent concentrates of ethanol eluents on acrylamide content

图6 不同浓度乙醇洗脱液对丙烯酰胺抑制率的影响Fig.6 Comparison of inhibition rates of acrylamide with different concentration of ethanol eluents

图5、图6可见,不同浓度乙醇洗脱液对土豆脆片中丙烯酰胺的形成均有抑制作用,其中25%的乙醇洗脱液的最佳抑制浓度为1.0×10-5mg/mL,其抑制率为24.69%,而55%和95%的乙醇洗脱液的最佳抑制浓度分别为1.0×10-3mg/mL,其抑制率分别为3.91%、15.44%,可见25%的乙醇洗脱液对丙烯酰胺的抑制效果优于55%、95%乙醇洗脱液,且其抑制率比正丁醇萃取物高44.04%,由此可见荸荠皮提取物的分离纯化物有助于土豆脆片加工中丙烯酰胺抑制率的提高,这为下一步从25%的乙醇洗脱液中分离筛选出更高效的丙烯酰胺天然抑制剂提供了科学依据。

3 结论

综上所述,在荸荠皮提取物应用于土豆脆片焙烤过程的丙烯酰胺抑制效果研究中发现,荸荠皮70%丙酮总提取物、不同极性萃取物、以及正丁醇萃取物经大孔树脂纯化分离后的乙醇洗脱液,均对土豆脆片焙烤中的丙烯酰胺的形成有抑制作用,且对抑制效果最好的部位进一步分离纯化的所得物,其丙烯酰胺抑制效果更好。其中,在70%丙酮总提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水萃取物中,正丁醇萃取物对丙烯酰胺的抑制效果最优,在最佳抑制浓度1.0×10-3mg/mL时，其抑制率达到17.14%;将正丁醇萃取物经D101大孔树脂纯化分离后,以不同梯度的乙醇溶液进行洗脱,3个不同浓度的乙醇洗脱液中,25%乙醇洗脱液对丙烯酰胺的抑制效果最好,在最佳抑制浓度1.0×10-5mg/mL时抑制率达到24.69%,其抑制率比正丁醇萃取物抑制率高44.04%,这说明在丙烯酰胺抑制的最高效部位进一步分离纯化,容易获得丙烯酰胺抑制活性最好的成分,此研究结果为进一步从荸荠皮中筛选具有更高活性的丙烯酰胺抑制成分指明了方向。