壮药透骨香抗类风湿关节炎药物活性部位筛选及机制研究

王丽，吕纪华，刘瑛，饶伟源，邓聿胤，覃良

(广西壮族自治区中医药研究院，广西中药质量标准研究重点实验室，广西 南宁 530022)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性系统性自身免疫疾病[1]，以关节和关节周围组织的非感染炎症为主要病变，好发于中年女性[2]，其机制错综复杂，其中T细胞介导的自身免疫异常在疾病进展过程中至关重要。透骨香为夹竹桃科植物筋藤(AlyxialevineiMerr.)的干燥根和茎[3]，是广西民间常用壮药，具有祛风除湿，消肿止痛的功效，用于治疗类风湿关节炎之关节疼痛，疗效甚佳，但其药物活性及作用机制研究未见任何报道。本研究采用T淋巴细胞体外增殖实验对透骨香抗RA作用的活性部位进行筛选，并初步探讨其作用机制，为透骨香治疗类风湿关节炎提供实验依据。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物 BALB/c小鼠，雄性，体重14～16 g，SPF级，购自广东省医学实验动物中心，生产许可证号：SCXK(粤)2013-0002。

1.2 药物 透骨香药材采自广西玉林市，经本研究院饶伟源主任药师鉴定为夹竹桃科植物筋藤(AlyxialevineiMerr.)后使用。透骨香药材8 kg采用60%乙醇加热回流提取，提取液回收乙醇后，药液分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行梯度提取分离，得到正丁醇部位25.1 g(提取率0.31%)、乙酸乙酯部位5.39 g(提取率0.07%)、石油醚部位0.40 g(提取率0.005%)和水溶部位364.3 g(提取率4.55%)共4 个部分，石油醚、乙酸乙酯及正丁醇部位用二甲基亚砜(DMSO)溶解成10 mg·mL-1储备液，水溶部位用RPMI-1640培养基溶解成10 mg·mL-1储备液，过滤除菌，实验时分别以RPMI-1640培养基稀释使用。

1.3 主要试剂 RPMI-1640培养基、胎牛血清(Hyclone公司)；小鼠脾脏淋巴细胞分离液试剂盒、青链霉素混合液(Solarbio公司)；细胞计数试剂盒8[CCK-8,东仁化学科技(上海)有限公司]；酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒(天津安诺瑞康生物技术有限公司)；刀豆蛋白A(CoA，Sigma公司)，实验时以RPMI-1640培养基配制成所需浓度。

1.4 主要仪器 H1850台式高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；Multiskan Go全波长全自动多功能酶标仪(Thermo Fisher Scientific公司)；MCO-18AIC二氧化碳培养箱(Panasonic 公司)。

1.5 实验方法

1.5.1 脾淋巴细胞的制备 取8只BALB/c小鼠，处死后用75%乙醇溶液浸泡10 min，生物安全柜内无菌条件下摘取脾脏，撕去脾脏包膜，用眼科剪剪成小块放置200目细胞筛网上，细胞筛网置于平皿(加入少量全血及组织稀释液)中，使用注射器活塞研磨脾脏，研磨完全后使用全血及组织稀释液冲洗筛网，收集细胞悬液后再经滤网过滤，获得脾脏单细胞悬液。取离心管，小心吸取单细胞悬液加于等量分离液液面上，保持两液面界面清晰，室温下，800 g离心20 min，离心后吸取第二层环状乳白色淋巴细胞至离心管中，加入细胞洗涤液洗涤白膜层细胞，250 g离心10 min，弃上清，5 mL细胞清洗液洗涤细胞2次(250 g离心10 min)，用RPMI-1640完全培养基(含10%胎牛血清，青链霉素100 U·mL-1)重悬细胞，制备成脾淋巴细胞悬液。

1.5.2 透骨香各部位对CoA刺激的T淋巴细胞增殖的影响 将脾淋巴细胞悬液调整为细胞密度1.0×106/mL，接种于96孔板中，每孔100 μL细胞悬液，实验分组处理如下：各部位药物组：每孔加入 50 μL CoA(终浓度为5 μg·mL-1)+50 μL药物(终浓度分别为5、2.5、1 μg·mL-1)；CoA组：每孔加入50 μL CoA(终浓度为5 μg·mL-1)+50 μL RPMI-1640培养基；阴性对照组：每孔加入100 μL RPMI-1640培养基；溶剂对照组：每孔加入50 μL CoA(终浓度为5 μg·mL-1)+50 μL DMSO溶液(终体积分数0.05%)。每组均设4个复孔。将96孔板置于37 ℃ 5% CO2培养箱中培养48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续培养4 h，酶标仪450 nm检测光密度(OD)值，计算淋巴细胞刺激指数(SI)。SI=实验组OD/阴性对照组OD。

1.5.3 透骨香水溶部位对细胞因子白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-10(IL-10)的影响 将脾淋巴细胞悬液调整为细胞密度1.0×106/mL，接种于96孔板中，每孔100 μL细胞悬液，实验分组处理如下：透骨香水溶部位组：每孔加入50 μL CoA(终浓度为5 μg·mL-1)+50 μL药物(终浓度分别为5、2.5、1、0.5 μg·mL-1)；CoA组：每孔加入50 mL CoA(终浓度为5 μg·mL-1)+50 μL RPMI-1640培养基；阴性对照组：每孔加入100 μL RPMI-1640培养基。每组均设6个复孔，37 ℃ 5% CO2培养箱中培养48 h后，收集细胞上清液，严格按照试剂盒要求采用ELISA法检测细胞因子IL-2、IL-10的含量。

1.6 统计学处理 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 透骨香各部位对CoA刺激的脾淋巴细胞增殖的影响 与阴性对照组比较，CoA组OD值显著升高(P<0.05)，刺激指数明显升高，提示CoA刺激脾淋巴细胞增殖作用显著；与CoA组比较，透骨香正丁醇部位(2.5 μg·mL-1)及水溶部位(5、2.5、1 μg·mL-1)组OD值显著降低(P<0.05)，刺激指数明显降低，其中水溶部位(5 μg·mL-1)作用最强，其余部位组及DMSO溶剂对照组均无明显差异(P>0.05)，提示透骨香水溶部位具有较强抑制脾淋巴细胞增殖的作用，结果见图1、表1。

图1 透骨香各部位对CoA刺激的脾淋巴细胞增殖的影响

组别剂量/μg·mL-1刺激指数阴性对照组-1CoA组-1.43151.428CoA+正丁醇部位2.51.30411.44351.465CoA+乙酸乙酯部位2.51.47011.41850.624CoA+水溶部位2.50.99211.358CoA+石油醚部位51.4072.51.40511.401

2.2 透骨香水溶部位对细胞因子的影响 与阴性对照组比较，CoA组IL-2、IL-10含量均显著升高(P<0.05)，提示CoA刺激脾淋巴细胞增殖后细胞因子分泌显著增强；与CoA组比较，透骨香水溶部位组(5、2.5、1 μg·mL-1)IL-2含量显著降低(P<0.05)，IL-10含量显著升高(P<0.05)，提示透骨香水溶部位对CoA刺激小鼠脾淋巴细胞分泌的细胞因子IL-2具有抑制作用，对细胞因子IL-10具有促进作用，结果见图2～3。

图2 透骨香水溶部位对CoA刺激的脾淋巴细胞分泌IL-2含量的影响

图3 透骨香水溶部位对CoA刺激的脾淋巴细胞分泌IL-10含量的影响

3 讨论

壮医药是我国中医药和民族传统医药的重要组成部分，RA属于中医“痹证”范畴、壮医的“发旺”范畴。壮医认为，病人多处潮湿之地，湿阻脉络，继而入骨，病久正气虚衰，气血不足，肝肾虚亏，气滞血瘀，虚实夹杂，正气损伤，湿滞黏腻，不易自散，故病情迁延难愈。治疗当以祛风除湿，消肿止痛，益气活血通络[4-6]。壮药透骨香为夹竹桃科植物筋藤(AlyxialevineiMerr.)的干燥根和茎，又名三托藤、九牛藤、坎香藤，主产于广西和广东，为广西民间常用草药，是民族药“五松肿痛酊”中的原料药材，具有祛风除湿，消肿止痛，祛腐生肌之功效，用于治疗类风湿关节炎引起的风湿痹痛、关节肿痛，效果甚佳。

RA是一种自身免疫性疾病，其中T淋巴细胞免疫功能异常是其发病的主要机制之一。研究证实，RA患者滑膜组织内存在T淋巴细胞的异常增殖和活化， T淋巴细胞活化后可调控巨噬细胞、B细胞、滑膜细胞、树突状细胞等功能，引起一系列免疫炎症反应，释放大量细胞因子、抗体及酶类，浸润滑膜组织，导致滑膜组织炎症和增生从而引起关节损伤[7]。脾脏中含有大量的T淋巴细胞，丝裂原ConA能够刺激T淋巴细胞活化增殖，促进其分泌细胞因子及表达受体[8]，因此体外T淋巴细胞增殖实验能够模拟RA免疫功能异常状态进行药物筛选实验。本研究结果显示，透骨香药物4个部位中，正丁醇部位及水溶部位能够明显降低ConA诱导的T淋巴细胞刺激指数，其中水溶部位(5 μg·mL-1)作用最强，提示透骨香水溶部位具有较强抑制T淋巴细胞增殖作用。

RA患者发病过程中，体内存在着T淋巴细胞亚群比例失衡，辅助性T细胞(Th)中Th1/Th2平衡紊乱，出现Th1极化和Th2分化阻碍[9]，引起细胞因子网络失调，滑膜细胞、淋巴细胞会产生大量炎症细胞因子，参与炎症迁延和关节损伤，其中细胞因子IL-2和IL-10发挥重要作用。IL-2主要由Th1细胞分泌，又称为T 细胞生长因子，可以与T 淋巴细胞表面的IL-2R结合激活T细胞，促进T细胞的活化与增殖，具有免疫增强和免疫调节的作用，研究表明，活动性RA患者血清中IL-2水平明显升高[10-11]。IL-10主要由Th2细胞分泌，是一种负性免疫调节因子，可以通过降低单核细胞抗原提呈能力，阻止抗原特异性T细胞增殖，减少单核细胞、中性粒细胞等产生促炎症细胞因子和趋化因子，抑制炎症反应[12-13]。本研究结果显示，透骨香水溶部位作用于ConA诱导的T淋巴细胞后，细胞因子IL-2含量显著降低，IL-10含量显著升高，提示透骨香水溶部位能够通过抑制T淋巴细胞分泌细胞因子IL-2，促进IL-10的生成，从而在RA中发挥免疫调节作用。

综上所述，本研究对壮药透骨香抗RA活性部位进行了筛选研究，明确了透骨香水溶部位对T淋巴细胞增殖具有较强抑制作用，是透骨香抗RA活性部位，其机制可能与调节细胞因子IL-2、IL-10分泌有关，为透骨香临床用于治疗RA提供了理论依据。但本研究仅限于药物部位筛选，透骨香药物化学成分及作用机制有待进一步深入研究。