HPLC同时测定茵栀黄颗粒中4种黄酮类成分

刘金宇，李艳芳,2，范建伟,2，刘武占,2

(1.鲁南厚普制药有限公司，山东 临沂 276006；2.中药制药共性技术国家重点实验室，山东 临沂 276006)

茵栀黄颗粒是由茵陈、栀子、黄芩、金银花4味中药提取物制成的常用中成药制剂，经“6912”注射液沿革而来[1]；具清热解毒，利湿退黄之功效，用于肝胆湿热所致的黄疸，症见面目悉黄、胸胁胀痛、恶心呕吐、小便黄赤，急、慢性肝炎见上述证候者[2]；临床上对新生儿生理性和病理性黄疸具有比较好的疗效[3-5]。

黄芩提取物具有抗菌抗炎、抗病毒、抗氧化、保肝利胆、抗癌等药理作用，现代研究表明黄芩提取物的主要药效物质是其中含有的黄芩苷、野黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等黄酮类成分[6-9]。《中国药典》2015年版中黄芩提取物是茵栀黄颗粒处方的主要组成部分(占60.25%)，因此仅仅控制黄芩苷的含量难以保证黄芩提取物及制剂的质量。本课题组前期曾对茵栀黄颗粒中环烯醚萜苷类成分同时测定[10]，为进一步深入研究茵栀黄颗粒的质量标准，严格控制其质量，本次实验采用高效液相色谱(HPLC)法同时测定茵栀黄颗粒中4种黄酮类成分野黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量。

1 仪器与材料

安捷伦1100高效液相色谱仪，美国安捷伦公司，OpenLAB CDS工作站；AG285型电子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司，KQ-250DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。对照品野黄芩苷(批号：110842-200403)、黄芩苷(批号：110715-200514)、汉黄芩苷(批号：112002-201702)、黄芩素(批号：111595-200905)购自中国食品药品检定研究院，均为含量测定用；对照品汉黄芩素(批号：MUST-14110311)购自成都曼斯特生物科技有限公司(质量分数≥98%)。茵栀黄颗粒由鲁南厚普制药有限公司提供(批号：00917229、00917230、00917231、00917232、00917233、00917234，3 g/袋)；乙腈为色谱纯，水为超纯水，甲醇和磷酸为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Kromasil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)梯度洗脱(0～15 min，5%～6%A；15～23 min，6%～10%A；23～42 min，10%～20%A；42～60 min，20%～25%A；60～90 min，25%～60%A；)；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：274 nm；柱温：30 ℃；进样量：5 μL。

2.2 对照品溶液制备 取野黄芩苷对照品、汉黄芩苷对照品、黄芩素对照品、汉黄芩素对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成各对照品储备液。精密量取各储备液适量，置100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得含野黄芩苷34.98 mg·L-1、汉黄芩苷53.19 mg·L-1、黄芩素70.92 mg·L-1、汉黄芩素9.6 mg·L-1的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备 取茵栀黄颗粒，研细，精密称取1 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入20 mL 50%甲醇，密塞，称定重量，超声30 min(功率250 W，频率40 kHz)，放冷，再称定重量，50%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性样品溶液制备 按茵栀黄颗粒处方比例及制备工艺制备缺黄芩提取物的阴性样品，按“2.3”项下方法操作，即得。

2.5 系统适用性 分别取上述3种溶液，在“2.1”项下色谱条件依法测定，色谱图见图1。由图可知，各待测成分色谱峰分离度均大于1.5；阴性样品色谱中，在与野黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素相对应的保留时间处无干扰。

1.野黄芩苷；2.汉黄芩苷；3.黄芩素；4.汉黄芩素图1 HPLC色谱图

2.6 线性关系考察 分别精密吸取“2.2”项下对照品溶液2、4、6、8、10 μL，按“2.1”项下色谱条件依次测定，记录峰面积。以峰面积Y为纵坐标，进样量X为横坐标进行回归，经计算得线性回归方程、相关系数r及线性范围。

结果分别为：野黄芩苷Y=5×106X-24 467，r=1.000，线性范围0.070 0～0.349 8 μg；汉黄芩苷Y=1×107X-17 371，r=1.000，线性范围0.106 4～0.531 9 μg；黄芩素Y=1×107X-140 218，r=0.999 9，线性范围0.141 8～0.709 2 μg；汉黄芩素Y=1×107X-11 383，r=0.999 9，线性范围0.019 2～0.096 0 μg。

2.7 精密度试验 取上述对照品溶液，按上述色谱条件，连续进样6次，结果各待测组分峰面积RSD分别为野黄芩苷0.55%、汉黄芩苷0.44%、黄芩素0.89%和汉黄芩素0.75%，显示仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验 取茵栀黄颗粒(批号：00917234)，按 “2.3”项下方法制备一份供试品溶液，分别于制备后0、4、8、12、16、24 h，按上述色谱条件测定，记录峰面积。结果各待测组分峰面积的RSD分别为野黄芩苷0.98%、汉黄芩苷1.41%、黄芩素1.33%和汉黄芩素1.22%。表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.9 重复性试验 取茵栀黄颗粒(批号：00917234)，按 “2.3”项下方法制备6份供试品溶液，按上述液相色谱条件测定分析。测得平均含有量为野黄芩苷0.548 2 mg·g-1、汉黄芩苷0.756 5 mg·g-1、黄芩素1.482 mg·g-1、汉黄芩素0.179 0 mg·g-1，RSD分别为1.00%、0.65%、1.12%、1.36%，表明方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验 取已知含有量的茵栀黄颗粒(批号：00917234)，研细，精密称取6份，每份0.5 g，置于具塞锥形瓶中，分别精密加入对照品储备溶液适量，按本试验供试品溶液制备及测定方法进行分析，具体结果见表1。

表1 加样回收率试验结果(n=6)

2.11 样品含有量测定 取6批茵栀黄颗粒适量，按本试验方法制备供试品溶液，并测定分析。具体结果见表2。

表2 含有量测定结果(n=3，mg·g-1)

3 讨论

《中国药典》2015年版规定茵栀黄颗粒(3 g/袋)含有黄芩苷180～220 mg[2]，即60.0～73.3 mg·g-1，本课题组前期研究发现野黄芩苷等4种成分总和仅在3.0 mg·g-1左右，说明黄芩苷与野黄芩苷等4种成分含有量差异较大，在同一条件下同时检测黄芩苷与野黄芩苷等4种成分的含有量，会产生较大的误差。因此本试验建立HPLC法同时测定茵栀黄颗粒中4种黄酮类成分野黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的含有量，未将黄芩苷同时测定。测定结果显示各待测成分含有量批次间差异较小，4种成分含有量总和在2.868～2.949 mg·g-1范围内，比较稳定，可用于进一步控制茵栀黄颗粒的质量。

以野黄芩苷等4种成分为指标，考察了超声、水浴提取两种提取方法，结果两种提取方法提取效率相差较小，最终选用了较方便的超声提取方法。另外经查阅文献黄酮类成分检测波长为280[11]、278[12]、275[13-14]、274 nm[15-16]等，本试验采用DAD检测器对样品全波长扫描，发现在274 nm下，野黄芩苷峰前面的干扰峰降至最低，对其含量测定无影响；其他3个成分亦均有较大吸收，且分离度均大于1.5，因此选取274 nm作为吸收波长。