马振邦 , 李霄阳 , 许 健 , 王 萍 , 李永清
(1.江西农业大学动物科学技术学院 , 江西 南昌 330045 ; 2.北京市农林科学院畜牧兽医研究所 , 北京 海淀 100097)
牛传染性鼻气管炎(IBR )是由牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)引起的急性,以呼吸道炎症为主的病毒性传染病[1]。牛传染性鼻气管炎病毒属于疱疹病毒科,疱疹病毒亚科,水痘病毒属,为线状双股DNA病毒,基因组大小约为138 Kb,可编码70 多种结构蛋白[2-3]。IBRV可侵袭多种器官和组织,在临床上表现呼吸困难、鼻炎、高热等症状,可引起严重的呼吸道疾病和生殖道疾病,导致动物产奶量降低、全身性感染及流产等[4]。目前,该病呈全球性分布,被世界动物卫生组织列为 B 类动物疫病,是严重阻碍我国养牛业健康发展的重大传染病之一[5]。IBRV 的 VP8 蛋白是成熟病毒粒子中含量最丰富的被膜蛋白,由2 226 bp开放阅读框编码的 742 个氨基酸组成。VP8 的一级结构和单纯疱疹病毒Ⅰ型UL47 开放阅读框同源,能够诱导机体产生体液免疫和细胞免疫应答[6]。VP8蛋白亚基上含有5个线性B细胞表位,其中sange1表位参与病毒的中和反应[7]。Dunn等也发现VP8同全长的VP4片段一样,能刺激机体产生中和抗体,从而激发免疫保护作用[8]。本试验将 VP8 蛋白进行原核表达、纯化,用纯化蛋白对SPF小鼠进行免疫,获取抗体血清。通过Western Blot 验证了重组VP8蛋白具有活性,为深入探究IBRV-VP8蛋白的生物学功能奠定基础。
1.1 材料 参考NCBI已公布IBRV-VP8基因序列(基因序列号:AY530215.1),设计扩增IBRVVP8 全长基因片段(2 235 bp),然后交由华大基因科技服务有限公司进行密码子优化并合成。该基因片段克隆于pET-32a原核表达质粒中,形成重组质粒(测序验证准确),命名为pET-32a-VP8。氨苄青霉素、脱脂奶、Anti-His(HRP 标记),购自康为世纪公司;包涵体纯化Ni柱填料,购自全式金生物技术有限公司;IPTG,购自TIANGEN公司;增强型HRP-DAB底物显色,购自TIANGEN公司;2种Prestained protein蛋白Marker,购自Thermo公司;核酸小分子量Marker,购自北京索莱宝科技有限公司。6周龄SPF级BALB/c小鼠,购自北京梅利亚维通实验动物技术有限公司,按照动物福利要求,饲养在本实验室动物房内。
1.2 方法
1.2.1 VP8重组蛋白的诱导表达 将表达IBRVVP8基因的重组表达质粒pET-32a-VP8转化入表达宿主Transetta(DE3)菌株内,均匀涂布到含氨苄青霉素浓度为100 mg/mL的LB固体培养基上,37 ℃培养过夜。
将pET-32a空载体和挑选的阳性菌各接种于5 mL的含氨苄青霉素(浓度为100 μg/mL)的液体培养基中,37 ℃ 200 r/min摇菌,待其菌液OD600值在0.4~0.6范围内时,取2.5 mL 阳性菌和pET-32a空载体加入IPTG至终浓度为0.5 mol/L诱导表达,剩余2.5 mL阳性菌不加 IPTG 诱导,一起放于37 ℃,200 r/min摇菌6 h。分别取阳性菌诱导与未诱导和pET-32a空载体诱导1 mL,12 000 r/min离心5 min,加等量PBS将沉淀悬起来,再按4∶1加5×SDS上样Buffer混匀后煮沸10 min,9 000 r/min离心1 min,取上清20 μL上样,进行蛋白电泳,考马斯亮蓝染色1 h,脱色并进行凝胶成像仪分析。
1.2.2 融合蛋白的可溶性鉴定 取3个3 mL含氨苄青霉素的LB液体培养基,按1∶100接阳性菌,37 ℃ 200 r/min摇菌,待其OD600值在0.4~0.6范围内时,分别加等量IPTG诱导(0.5 mol/L),之后于16 ℃、25 ℃、37 ℃ 200 r/min摇菌6 h,取等量菌体超声波裂解,离心,分别取上清和沉淀进行蛋白电泳分析最佳诱导温度,以及是否低温诱导影响表达蛋白的可溶性。取阳性菌接菌于6个 3 mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中,37 ℃ 200 r/min摇菌,待其OD600值在0.4~0.6 范围内时,分别加IPTG终浓度为0.25 mol/L、0.5 mol/L、0.75 mol/L、1.0 mol/L、1.25 mol/L、 1.5 mol/L诱导6 h,进行蛋白电泳分析最佳IPTG诱导浓度。
1.2.3 表达产物的纯化 在最佳温度和最佳IPTG浓度下诱导融合蛋白大量表达,8 000 r/min离心30 min取菌体沉淀,于Binding Buffer中重悬菌体,超声裂解,并进行过滤;打开Ni-NTA His-Bind Resin亲和层析柱下端的塞子,让预装柱中的保护液平衡柱子之后慢速流出;用至少20 mL 的超纯水缓慢冲洗Ni柱;用至少20 mL Binding Buffer 缓慢加入Ni柱,短暂停留后让其缓慢自然流出,仅增加Ni柱的吸附能力;将重组蛋白溶液沿 Ni 柱管壁缓慢加入,控制Ni柱下端出口流速为5~6滴/min,将流过Ni柱的穿流液收集后再次上样,以增加蛋白回收量;缓慢加入大约40 mL Washing Buffer 使其缓慢流出 Ni 柱;加入5 mL Elution Buffer于Ni柱中,放置30 min,调整较慢的流速(2~4滴/min)同时一直用考马斯亮蓝 G250 检测流出的蛋白液颜色变化,待蓝色几乎消失后停止收集;用 SDS-PAGE 检测纯化效果,将纯化好的蛋白待复性任何溶液过柱子前都要经过0.22 μm滤器过滤。蛋白复性:处理透析袋,将纯化出来的蛋白透析在2 L的50 mM Tris、300 mM NaCl、4.5 mM 尿素透析液中,之后依次降低缓冲液中的尿素浓度3.5 mM、2.5 mM、2 mM、1.5 mM、1 mM、0.5 mM、0 mM 每个浓度透析8 h,最终透析到PBS中。
1.2.4 表达产物的Western Blot分析 将纯化的目的蛋白进行SDS-PAGE电泳,然后15 V,50 min 转印到硝酸纤维素膜上,用5%脱脂奶的 PBST 4 ℃过夜封闭,使用抗 His 标签的鼠源单克隆抗体(1∶5 000 稀释)孵育 1.5 h,然后用HRP 标记的山羊抗小鼠抗体(1∶10 000 稀释)孵育 50 min,之后DAB 显色,终止显色。
1.2.5 多克隆抗体的制备 6周龄小鼠15只,按照免疫程序,每只于颈背部皮下多点注射复性蛋白50 μg,首免采用弗氏完全佐剂,之后用弗氏不完全佐剂进行3次加强免疫,每次免疫间隔 2 周。免疫完成后第2周进行眼球采血,每隔2 d采1次,分离血清,-80 ℃冻存。 将纯化的目的蛋白和纯化的病毒BoHV-1进行SDS-PAGE电泳,然后15 V,50 min转印到硝酸纤维素膜上,用5%脱脂奶的 PBST 4℃过夜封闭,使用鼠抗VP8多克隆抗体阳性血清(1∶500 稀释)孵育1.5 h,然后用HRP标记的羊抗鼠的抗体(1∶10 000 稀释)孵育50 min,之后DAB显色,终止显色。
2.1 VP8蛋白的原核表达 由华大基因科技服务有限公司优化构建的pET-28a-VP8,未见表达,用EcoRI与XhoI双酶切转于pET-32a 载体上,VP8片段大小为2 235 bp,加上pET-32a上的标签,融合蛋白分子量约为110 kDa。如图1,pET-32a空载体和未诱导的pET-32a-VP8无特异性条带表达,诱导的pET-32a-VP8显示110 kDa左右条带。
图1 pET-32a-VP8融合蛋白表达的SDS-PAGE结果
2.2 融合蛋白的可溶性分析 16 ℃、25 ℃、37 ℃分别诱导pET-32a-VP8后,超声裂解细胞,对上清与沉淀分别进行SDS-PAGE蛋白电泳,如图2,诱导的pET-32a 空载体和pET-32a-VP8未诱导未见目的条带, pET-32a-VP8 诱导后可见目的条带,pET-32a-VP8 诱导后上清未见目的条带,pET-32a-VP8 诱导后沉淀中可见110 kDa的目的条带,说明融合蛋白以包涵体的形式存在,并在37 ℃时蛋白表达量较高。
2.3 融合蛋白的最佳IPTG浓度 将pET-32a-VP8在最佳温度37 ℃时,摇菌至OD600值于0.4~0.6之间时,加不同浓度的 IPTG诱导6 h,取等量菌体,离心,变性,进行SDS-PAGE电泳,如图3,结果为在1.0 mol/L时融合蛋白条带最粗,表明在IPTG浓度为1.0 mol/L时,蛋白表达量最大。
2.4 融合蛋白的纯化结果 His-Ni柱纯化蛋白,上柱前样品、上柱后流出液、Washing Buffer 洗脱组分、Elution Buffer洗脱组分,每阶段分别取100 μL,进行10%的SDS-PAGE电泳分析,如图4显示,表明纯化结果良好。
图2 融合蛋白的可溶性分析
图3 不同 IPTG 浓度诱导
图4 pET-32a-VP8 蛋白纯化结果
2.5 Western Blot分析 将纯化的目的蛋白进行SDS-PAGE电泳,转印到硝酸纤维素膜上,用5%脱脂奶的 PBST 4 ℃过夜封闭,一抗为抗His标签鼠单克隆抗体孵育1.5 h,二抗用HRP标记的羊抗鼠 IgG孵育50 min,之后DAB显色,终止显色。结果如图5显示条带正确,验证VP8的表达,非特异性条带较少,表明纯化效果良好。
2.6 多克隆抗体的制备 将纯化的目的蛋白和纯化的病毒IBRV进行SDS-PAGE电泳,然后转印到硝酸纤维素膜上,用5%脱脂奶的PBST 4 ℃过夜封闭,先用鼠抗VP8多克隆抗体阳性血清,然后用HRP 标记的羊抗鼠的抗体,Western Blot检测。如图6和图7,结果表明,特异性良好,此多抗可以与纯化的病毒特异结合,说明有免疫原性。
图5 融合蛋白的WB结果
图6 纯化蛋白与多克隆抗体的 WB
图7 纯化病毒 IBRV与多克隆抗体的WB
牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV),又名牛疱疹病毒1型(BHV-1),是引起牛的一种急性、热性、接触性传染病的病原[8-9]。我国大部分省市地区的奶牛、黄牛、水牛和牦牛均有不同程度感染。牛是IBRV的唯一感染宿主,牛感染后在自然条件下形成潜伏感染且不定期排毒[10]。VP8 蛋白是牛传染性鼻气管炎病毒IBRV的壳膜蛋白,大小约为97 kDa[11],对病毒于牛体内的复制是必需的。在牛体内,VP8 刺激 T 细胞增殖产生抗体,VP8可以导致体液免疫反应和细胞免疫反应,所以这个蛋白很重要。病毒感染宿主细胞后,大部分衣壳蛋白被释放至细胞质内,表明这些蛋白是最初与细胞内环境相互作用的物质[12]。疱疹病毒衣壳蛋白有多种功能,包括病毒衣壳运输、DNA 复制、转录和翻译的调节、病毒的组装与释放。这些功能提示衣壳蛋白为病毒复制提供合适的环境,而 VP8 蛋白就是其中之一的衣壳蛋白。VP8在IBRV病毒粒子中是最多的蛋白[13],与病毒对牛的致病力有关[14]。病毒进入细胞后2 h,VP8就大量出现,在细胞核与细胞质之间穿梭[15]。目前关于 VP8 结构和功能的研究相对较少,其中一些是关于VP8磷酸化的研究,研究表明,IBRV的VP8单纯疱疹病毒1型(HSV-1)的VP13/14 同源,VP8是磷酸化和糖基化的蛋白,包含核定位信号和核输出信号,病毒激酶 US3和蛋白激酶 CK2可使VP8磷酸化[16]。
通过EcoR I和XhoI酶进行体外重组连接克隆,本试验成功构建了IBRV的pET-32a-VP8融合表达质粒,诱导后的pET-32a-VP8 在温度37 ℃与IPTG浓度为1.0 mol/L时,蛋白表达量最高。通过His-Ni柱对包涵体融合蛋白VP8进行了纯化,并免疫小鼠成功获得抗IBRV的VP8蛋白的多克隆抗体。Western Blot免疫印迹证明,IBRV-VP8能与制备的抗IBRV的VP8蛋白的小鼠多克隆抗体特异性结合,表明表达纯化的融合蛋白VP8蛋白具有良好的免疫原性。本试验构建的IBRV的pET-32a-VP8表达载体、表达纯化的融合蛋白以及获得的小鼠多克隆抗体,为进一步探究IBRV的VP8蛋白的生物学功能提供科学依据。