镇江地区副猪嗜血杆菌分离鉴定血清型及耐药性检测

朱孟玲 ， 刘庆新 ， 孙智远 ， 徐云明 ， 章 琰 ， 王永娟

(1.江苏农林职业技术学院 ， 江苏 镇江 212000 ；2. 江苏农牧科技职业学院 ， 江苏 泰州 225300)

副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis，Hps)是临床中猪呼吸道常见的一种革兰阴性菌，该菌的形态具有多形性，主要侵害4～8周龄仔猪，临床中主要表现为纤维素性胸膜炎、腹膜炎、心包炎、关节炎及脑膜炎等多种症状，其仔猪的发病率为10%～15%以上，严重时死亡率可达50%[1-3]。研究表明，Hps在英国、澳大利亚、美国等多个国家及我国的黑龙江省、辽宁省、山东省、河南省等多个地区普遍流行，该病与猪蓝耳病、圆环病毒等病毒病混合感染，在我国其感染造成的损失相当严重，该病已经成为影响全球养猪业健康发展的主要细菌病之一[4]。Hps具有15个血清型， 20%左右的分离菌株未能鉴定出血清型，不同的地区流行的血清型不同，商品化疫苗难以对各种血清型Hps提供完全交叉保护[5-6]。Hps的防治主要依靠抗菌药物，但由于长期不合理使用，导致Hps对临床中常用抗菌药物产生耐药性，降低其治疗效果[7-8]。

本试验从镇江地区85份患病猪的病料组织中分离得到了48株副猪嗜血杆菌，对分离的48株副猪嗜血杆菌分离菌株进行血清型分布及耐药性检测，为该地区副猪嗜血杆菌的防控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品来源 2019年3-6月，采集镇江地区不同养殖场中患病仔猪的肺脏、肝脏、关节渗出液等病料组织85份。

1.2 主要试剂与仪器 巧克力培养基、7%绵羊血培养基、胰蛋白胨大豆固体培养基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)，均购自青岛高科园海博技术有限公司；生化微量管,购自北京奥博星生物技术有限公司；200 mL无支原体胎牛血清,购自浙江天杭生物科技股份有限公司；氧化型辅酶1(NAD),购自北京索莱宝科技有限公司；2×TaqMarker Mix,购自北京康为世纪生物科技有限公司；DL-2 000 Marker,购自北京中科瑞泰生物公司；细菌药敏纸片，购自温州康泰生物科技有限公司。梯度PCR仪由美国ABI公司生产；凝胶成像系统由美国伯乐公司生产；恒温培养箱、恒温水浴锅，均由上海恒一科技有限公司生产；常规的试剂与仪器由本实验提供。

1.3 分离与鉴定 将采集的患病仔猪的肺脏、肝脏、关节渗出液等病料组织进行处理后，接种于7%绵羊血培养基上，在37 ℃恒温箱中培养18-24 h，挑取单个菌落分别接种在TSA 培养基和巧克力培养基上，37 ℃恒温箱中培养24-36 h，挑取单个菌落在TSB 进行纯化培养，进行革兰染色镜检观察其形态。

1.4 生化鉴定试验 取纯化分离菌株，按照说明书接种于生化试剂管中，对分离菌株进行生化鉴定。

1.5 分离菌株的PCR鉴定 参考文献[4]合成Hps特异性鉴定引物。P1：5′-GTGATGAGGAAGGGTGGT-3′，P2：5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′，目的基因片段840 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用水煮法提取分离菌株的基因组DNA，以提取的DNA为模板，用Hps特异性鉴定引物进行PCR鉴定，其分离菌株的 PCR扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果与GenBank中登录参考株进行同源性比较。

1.6 分离菌株的血清型鉴定 参考文献[9]，合成 14 个 Hps 血清型基因引物funB、wzx、glyC、wciP、wcwK、gltI、funQ、scdA、funV、funX、amtA、gltP、funAB和funI，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 PCR反应体系50 μL：2×TaqMarker 25 μL，引物P1、P2各2 μL，DNA模板2 μL，去离子水19 μL。94 ℃预变性 5 min; 94 ℃变性 30 s, 58 ℃复性30 s, 68 ℃延伸 60 s，30个循环;最后68 ℃延伸5 min。将扩增后的 PCR 产物于 1%琼脂糖上凝胶电泳，电泳结束后用凝胶成像系统观察结果并照相记录。

1.7 分离菌株的药敏试验 按照美国临床检验标准委员会(NCCLS)推荐的标准K-B纸片法进行，按照美国临床和实验室标准协会(CLSI)的标准判断耐药(R)、敏感(S)或中介(I)进行结果判断与耐药性分析。取纯化培养的分离菌株，调整菌液浓度为0.5麦氏比浊度，均匀涂布于TSA，贴上药敏纸片，37 ℃培养18-24 h，测量抑菌圈直径(mm)。

2 结果

2.1 细菌分离与培养 疑似副猪嗜血杆菌在7%绵羊血培养基圆形的、边缘整齐的、灰白色菌落；在TSA培养基上长出湿润的、光滑的、边缘整齐的、灰白色的菌落；在巧克力培养基上长出圆形的、隆起的、表面光滑的、整齐的、灰白半透明的菌落。革兰染色镜检结果，分离菌株为短杆状、球状、杆状等多形性。经统计，48株分离菌株与报道的副猪嗜血杆菌的培养特性及形态一致。

2.2 分离菌株生化鉴定结果 分离菌株均能分解果糖、蔗糖、葡萄糖、半乳糖、麦芽糖和阿拉伯糖；不分解甘露醇；吲哚试验为阴性；接触酶试验为阳性；脲酶、氧化酶、鸟氨酸脱氢酶均为阴性，经统计48株分离菌株的生化特性与报道的副猪嗜血杆菌生化特性基本相符。

2.3 细菌PCR鉴定结果 用副猪嗜血杆菌特异性鉴定引物对分离的48株分离菌株均扩增出大约为840 bp大小的目的基因(图1)。测序结果显示：分离的48株菌株的测序结果与GenBank库中登录的10株副猪嗜血杆菌参考株基因序列的同源性在97.9%～99.9%之间。说明分离的48株分离菌为副猪嗜血杆菌。

图1 分离菌株PCR鉴定结果

2.4 血清型鉴定结果 分离的48株副猪嗜血杆菌用血清型基因引物扩增出7种血清型目的条带(图2)。经统计，血清5型和12型为该地区副猪嗜血杆菌流行的主要优势血清型，分别占分离菌株的25.0%和31.3%(表1)。

图2 分离菌株血清型PCR鉴定结果

表1 血清型检测结果

2.5 耐药性结果 由表2可知，分离的48株副猪嗜血杆菌对磺胺间甲氧嘧啶、阿莫西林、庆大霉素、青霉素4种药物耐药性最高，耐药率在81.3%～100.0%之间；对氨苄西林、大观霉素、多粘菌素、多西环素、氟苯尼考5种药物耐药率在50.0%～79.2%之间；对头孢噻呋、头孢曲松、恩诺沙星、环丙沙星、林可霉素5种药物耐药率相对较低，耐药率在12.5%～25.0%之间。

表2 副猪嗜血杆菌耐药性分析结果

3 讨论

副猪嗜血杆菌是临床中常见的危害养猪业的主要病原菌之一，该菌对仔猪危害较低，发病率10%～15%，但死亡率高达50%以上，Hps属于条件致病菌，当外界环境改变或感染其他病原菌时，导致猪的抵抗力降低，可以诱导该病的发生与流行[8-10]。Hps主要通过空气、直接接触及排泄物等多种途径传播，该菌主要引起猪肺脏疾病，除直接引起患猪死亡外，还可以导致猪生长性能降低、继发多种病原感染，从而使肉品质下降，引起食品安全问题[5-7]。因此，在养殖过程中要注意该病的防控，同时也要注意环境的消毒。本试验从镇江地区采集86份病料组织分离得到了48株副猪嗜血杆菌，说明副猪嗜血杆菌在该地区正在流行，应该引起重视。

目前报道Hps具有15个血清型，其中20%的临床分离菌株不能成功分型。本试验表明，分离的48株Hps具有7种血清型，其中以血清5型和12型为该地区副猪嗜血杆菌流行的主要优势血清型，分别占分离菌株的25.0%和31.3%，可以将血清5型和12型作为研制灭活苗的候选菌株之一。蔡旭旺等[11]报道了我国副猪嗜血杆菌分离菌株以血清4型和5型为主要流行的血清型，其次是13型、14型和12型。于江等[12]报道了副猪嗜血杆分离菌株血清1型在我国也较为流行。说明了副猪嗜血杆分离菌株的血清型的流行情况可能因地区不同存在一定的差异性，因此，该菌的疫苗研制存在一定困难。

由于目前没有有效疫苗用于预防副猪嗜血杆菌，抗生素成为防治该病的主要手段之一，不合理的使用，不仅导致副猪嗜血杆菌产生很强的耐药性，同时还降低治疗效果[13]。本试验表明，分离的48株副猪嗜血杆菌对磺胺间甲氧嘧啶、阿莫西林、庆大霉素等9种药物耐药率在50.0%～100.0%之间，对其他药物耐药率在12.5%～25.0%之间。因而说明该区分离的副猪嗜血杆菌耐药严重，可能与临床不合理使用抗菌药物有关，也可能由于副猪嗜血杆菌的耐药机制发生改变引起耐药性。因此，在发生该病时应该合理使用抗菌药物，减少耐药性产生，提高治疗效果。