新西兰兔Keap1基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

2019-04-16 12:41范志宇魏后军仇汝龙陈萌萌宋艳华朱伟峰徐为中
中国兽医杂志 2019年9期
关键词:质粒定量新西兰

胡 波 , 范志宇 , 魏后军 , 仇汝龙 , 陈萌萌 , 宋艳华 , 朱伟峰 , 徐为中 , 王 芳

(江苏省农业科学院兽医研究所 农业部兽用生物制品工程技术重点实验室 , 江苏 南京 210014)

Keap1-Nrf2-ARE是目前发现的最重要的抗氧化应激通路,其可调节各种内外环境引发的氧化应激,减少细胞受到的氧化损伤[1]。Keap1是Nrf2蛋白的主要抑制因子,被认为是氧化应激的感受器[2],其与Nrf2蛋白的互作对抗氧化应激通路的调控具有重要作用[3-4]。病毒感染、炎症等许多疾病的发生发展均与氧化应激密切相关[5-6],但到目前为止,兔作为一种广泛用于病理学、生理学及免疫学等研究的试验动物,其抗氧化应激通路关键基因的表达水平仍缺乏相应的检测手段,而Keap1、Nrf2等基因的表达水平反映了该通路的激活或抑制情况。此外,Keap1也是一种肿瘤抑制因子,其能结合并促进致癌酶IKK的泛素化降解,且Keap1基因的表达水平与病人死亡率直接相关[7]。本试验以新西兰兔为对象,建立了兔Keap1基因荧光定量PCR检测方法,为研究兔Keap1基因的表达调控及在相关疾病中的作用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和工具酶 RNAiso Plus、反转录试剂盒、TB Green Premix ExTaqⅡ、pMD-19T载体、T4 DNA连接酶、核酸凝胶回收试剂盒,购自TaKaRa公司;DEPC水,购自北京索莱宝科技有限公司;DH5α感受态细胞、DNA Marker DL-2 000、1.1×Pfu Master Mix,购自南京擎科生物科技有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 试验动物及样品采集 2月龄健康新西兰母兔2只,购自金陵种兔场,耳静脉空气针处死后,分别采集心、肝、脾、肺、肾、脑等组织,置于-80 ℃保存。

1.3 引物设计 参照GenBank中穴兔Keap1基因序列(NO.XM008251548),利用Primer 5.0软件分别设计用于扩增Keap1基因C端的引物和检测Keap1基因的特异性鉴定引物(表1),由南京擎科生物科技有限公司合成。

表1 兔Keap1基因引物序列

1.4 RNA的提取及cDNA的合成 使用RNAiso Plus提取兔心、肝、脾、肺、肾、脑等组织悬液的总RNA,以反转录试剂盒进行cDNA的合成。反转录反应条件:37 ℃反应15 min,85 ℃反应5 s,4 ℃保存备用。

1.5 标准阳性质粒的制备 以Keap1C-F和Keap1C-R为上下游引物,通过PCR扩增、回收、连接及转化,构建重组质粒pMD-19T-Keap1C。反应体系:cDNA 4 μL,Pfu Master Mix 44 μL,10 μM上、下游引物各1 μL,总体积50 μL。反应条件:94 ℃ 2 min;94 ℃ 15 s,56 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,35个循环;72 ℃ 5 min。1.0 %琼脂糖凝胶电泳后,将目的片段回收、纯化,并克隆入pMD-19T载体,转化E.coliDH5α感受态细胞,过夜培养后挑取单菌落,送至南京擎科生物科技有限公司测序。

1.6 荧光定量PCR检测方法的建立

1.6.1 标准曲线的建立 测定pMD-19T-Keap1C质粒浓度并10倍系列稀释作为标准质粒模板,按罗氏480 PCR仪的反应体系和条件进行实时荧光定量PCR。反应体系:TB GreenTMPremix ExTaq10 μL,10 μM上、下游引物各0.8 μL,质粒模板 2 μL,加ddH2O至总体积20 μL。扩增程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 20 s,40个循环。以模板拷贝数的对数为横坐标,以Ct值为纵坐标,绘制标准曲线。

1.6.2 敏感性和重复性检测 以10倍系列稀释的标准质粒为模板分别进行实时定量PCR和普通PCR,检验方法的敏感性。将不同稀释度的标准品进行重复检测,计算组间和组内变异系数,分析方法的重复性。

1.7Keap1在兔组织中的含量检测 以2只新西兰兔不同组织提取的cDNA为模板,兔β-actin为内参基因,进行实时荧光定量PCR检测,并采用2-ΔΔCt算法,计算Keap1在兔不同组织中的相对表达量。

2 结果

2.1Keap1基因扩增及阳性质粒的制备 以TRIzol法提取新西兰兔肝脏的总RNA,并以反转录得到的cDNA为模板扩增Keap1基因C端。结果显示,获得大小约600 bp的特异性条带(图1)。经回收纯化并连接pMD-19T载体后,挑取阳性菌落测序。经序列比对,所扩增的Keap1基因C端序列与GenBank上穴兔Keap1基因序列的同源性为100%,表明阳性质粒pMD-19T-Keap1C制备成功,经测定,质粒浓度为5.28×1011拷贝/μL。

2.2 标准曲线的绘制 将阳性质粒pMD-19T-Keap1C进行10倍系列稀释,以不同浓度的质粒为标准品模板进行荧光定量PCR扩增,每个样品稀释度做3个重复试验。结果表明,新西兰兔Keap1基因标准曲线Ct值和标准质粒浓度间呈现良好的线性关系,y=-3.174x+39.69,R2=0.999 2(图2),扩增效率为103%。

图2 新西兰兔Keap1基因标准品的扩增曲线(A)和标准曲线(B)

2.3 敏感性检验 用建立的荧光定量PCR方法对10倍系列稀释标准质粒进行检测,结果显示,实时荧光定量PCR方法的敏感性是普通PCR方法的1 000倍(图3)。

图3 新西兰兔Keap1基因标准质粒荧光定量PCR(A)和普通PCR(B)检测

2.4 重复性检验 将6个不同稀释度标准质粒(5.28×109~5.28×104拷贝/μL)重复检测3次,并于不同时间再分别检测3次。经计算,组内变异系数CV为0.2%~1.1%,组间变异系数CV为1.3%~3.7%。

2.5Keap1基因在兔不同组织中的表达差异分析 用建立的实时荧光定量PCR方法对2月龄新西兰兔各组织进行检测。结果显示,Keap1和β-actin的熔解曲线为单峰,特异性良好(图4)。Keap1 mRNA在兔心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑中均可检测到,且在肝脏中表达最高,在脾脏中表达最低。经GraphPad Prism 5软件单因素方差分析,相对于Keap1基因在脾脏的表达水平,Keap1在心脏和肾脏的表达水平与脾脏之间存在显著差异(P<0.05),Keap1在肝脏、肺脏和脑的表达水平与脾脏之间存在极显著差异(P<0.01)(图5)。

3 讨论

活性氧(ROS)自由基引发的氧化应激涉及到多种疾病的病理过程。Keap1是调控抗氧化应激通路中Nrf2活性的主要分子。当机体遭遇病毒感染、重金属暴露等各种内外环境刺激后产生大量ROS,使Nrf2与Keap1解偶联并入核,启动下游靶基因的转录和表达[8-9]。研究发现,在砷引起中毒的研究中,砷暴露引起机体Keap1表达下调和Nrf2表达上调,从而影响机体的氧化应激水平[10]。在乳腺癌研究中,Keap1的表达上调促进了IKK的降解,提高了病人的存活率[7]。另外,Keap1-Nrf2-ARE和NF-κB这两条细胞内重要的信号通路共同参与多个生物反应进程,它们之间相互关联和影响。据报道,Keap1是联系两条信号通路的直接信号分子,NF-κB通路中的p65可以增强Keap1的稳定性从而增强对Keap1-Nrf2-ARE通路的抑制作用[11],而Keap1也能抑制NF-κB信号通路[7]。可见,Keap1的表达水平对机体抗氧化应激通路和NF-κB通路的活性均有重要意义。

图4 熔解曲线分析

图5 Keap1 mRNA在新西兰兔不同组织中的表达情况

本试验建立了Keap1基因的荧光定量PCR方法,并通过构建的标准质粒建立了标准曲线,扩增得到了良好的S型曲线。熔解曲线分析显示扩增产物熔解温度均一,平均为90 ℃左右。所建立的方法具有良好的敏感性和重复性,可检测到浓度为52.8拷贝/μL的样品,组内、组间变异系数均小于5%。对新西兰兔不同组织mRNA的检测发现,Keap1基因在肝脏中表达最高,在脾脏中表达最低,这可能与各组织不同的生理功能有密切关系。本试验建立了新西兰兔Keap1基因荧光定量PCR检测方法,并检测了其在新西兰兔各组织中的表达差异,为以新西兰兔作为研究对象或模型动物的抗氧化应激相关研究奠定了基础。

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