非洲猪瘟病毒国家标准物质的研制

原 霖 , 杨 林 , 辛盛鹏 , 宋晓晖 , 董 浩 , 刘 洋 , 韩 焘 ,高旭年 , 李尔华 , 钟凤然 , 陈亚娜 , 王传彬

(1.中国动物疫病预防控制中心 ， 北京 大兴 102618 ； 2.广州邦德盛生物科技有限公司 ， 广东 广州 510000)

世界卫生组织(WHO)于1997年发布了第一个核酸国际标准物质-丙型肝炎核酸国际标准物质，到目前为止已发布同类标准物质16种[1]。我国的标准物质研制起步较晚，国家标准物质资源共享平台可查询到的核酸标准物质也主要是涉及微生物及转基因植物等领域。相比其他领域，我国兽医领域标准物质的研究更是较为滞后，目前兽医领域的有证标准物质只有2018年由中国动物疫病预防控制中心研制的猪繁殖与呼吸综合征欧洲株(PRRSV LV)、猪繁殖与呼吸综合征美洲变异株(PRRSV JXA1)、猪繁殖与呼吸综合征美洲经典株(PRRSV VR2332)3种核酸标准物质。近年来兽医领域的研究者们也对研制动物病原核酸标准物质进行了相关探索，主要为禽流感、新城疫和亚洲I型口蹄疫病毒等方面[2-4]，但这些研究成果未经过国家标准物质技术委员会的评审，未形成有证书的标准物质。

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起猪的一种急性、热性、高度传染性疾病。该病病程短，死亡率高，对养猪业危害甚大，有着重要的社会经济学意义，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物疫病之一，我国将其列为一类动物疫病[5]。2018年8月3日，农业农村部发布我国首例非洲猪瘟疫情。截止2019年8月非洲猪瘟进入中国1年，我国所有省份均有疫情发生，农业农村部共发布疫情152起，累积扑杀生猪100余万头。目前非洲猪瘟无有效疫苗，唯一的防控手段只能加强养殖场生物安全和进行早期诊断检测。农业农村部也要求生猪生产环节、调运环节和屠宰环节都需对非洲猪瘟病毒进行检测，并联合市场监管总局和工业和信息化部联合下文要求猪肉制品加工企业也开展非洲猪瘟病毒检测。在《OIE陆生动物诊断与疫苗手册》中，荧光定量PCR是检测非洲猪瘟病毒的推荐方法，然而目前并没有非洲猪瘟病毒的标准物质，使得无法对各实验室的非洲猪瘟病毒的检测能力以及商品化非洲猪瘟检测试剂进行有效的评价。

1 材料

1.1 主要试剂 E.Z.N.A.®Plasmid Mini Kit和OMEGA Gel Extraction Kit，购自OMEGA公司；QuantStudioTM3D Digital PCR 20K Chip Kitv2 and Master Mix，购自thermo公司；One-Step RT-ddPCR Kit for Probes，购自伯乐公司；引物探针由英潍捷基有限公司合成。

1.2 主要仪器 KINGFISHER DUO自动化核酸提取仪，QX200 Droplet Generator、QX200 Droplet Reader、QX200微滴式数字PCR仪，QuantStudio 3D Digital PCR System芯片式数字PCR仪，普通PCR仪，ABI 7500实时荧光定量PCR仪器。

2 方法

2.1 pUC19-P72质粒的构建 根据NCBI数据库中上传的ASFV的P72基因序列，用Primer Premier 5.0软件设计了含分别BamH I和EcoR I酶切位点的扩增P72基因全长序列的特异性引物(ASFV 上游引物5′-CGGGATCCTTAGGTACTGTAACGCAGCA-3′和ASFV 下游引物5′-CGGAATTCATGGCATCAGGAGGAGCT-3′)。

对感染ASFV的病死猪病料组织研磨液进行核酸提取和PCR扩增。回收PCR扩增产物并进行双酶切。将经过BamH I和EcoR I双酶切的扩增产物与同样经过双酶切的pUC19载体进行连接反应，并转化DH5α感受态细胞。对转化获得的克隆进行PCR鉴定和双酶切鉴定，并送中美泰和生物技术(北京)有限公司进行测序。

2.2 pUC19-P72质粒的提取 将经过测序验证的阳性克隆，接入 10 mL含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于37 ℃，200 r/min摇床培养12-14 h。按OMEGA公司“E.Z.N.A.®Plasmid Mini Kit”试剂盒的操作说明书进行质粒的提取。

2.3 pUC19-P72质粒的纯度分析 按照国家标准GB/T34796-2017规定，以及《分子克隆》有关试验要求，采用紫外分光光度法对质粒的纯度进行考察。纯的DNA的A260/A280应大于1.8，而A260/A230应该达到2.0。

2.4 均匀性评估 随机抽取标准物质30管样本，每管样本检测3次。采用数字PCR方法进行检测。使用单因素方差分析方法对标准物质进行均匀性评估。

2.5 稳定性评估 为了评估标准物质的稳定性，分别进行了长期稳定性评估和短期稳定性评估。

2.5.1 长期稳定性评估 进行长期稳定性评估的抽样方法为：标准物质在-20 ℃的储存条件下，在第1，2，4，6，9，12个月抽取5管非洲猪瘟病毒标准物质，每个样品检测2次。使用数字PCR方法进行检测，计算平均值。使用回归方法对非洲猪瘟病毒标准物质进行长期稳定性评估。

2.5.2 短期稳定性评估 进行短期稳定性评估的抽样方法可为：标准物质在4 ℃、25 ℃、37 ℃环境下存放30 d、15 d、9 d。抽取3瓶的非洲猪瘟病毒标准物质，每个样品检测1次。使用数字PCR方法进行检测。使用回归方法对非洲猪瘟病毒标准物质进行短期稳定性评估。

2.6 标准物质的定值 非洲猪瘟病毒标准物质通过多个实验室合作定值方式进行定值。委托9家实验室，采用数字PCR方法对标准物质的特性值进行测量。定值数据进行组内可疑值检验、组间数据等精度检验剔除可疑值。当各组数据等精度时，用t检验方法检验各组数据平均值是否有显著性差异。如平均值无显著性差异，先合并数据，检验数据分布的正态性，在符合正态分布的情况下，可将多个平均值再次计算平均值，求出总平均值，即为标准值。

2.7 不确定度的评定 对于标准物质来说，其定值结果的不确定度由3部分组成，分别为标准物质的均匀性引入的不确定度ubb，标准物质的稳定性引入的不确定度us以及标准物质的定值过程引入的不确定度uchar。定值过程引入的不确定度分为不确定度的A类评定uA和不确定度的B类评定uB。不确定度A类评定通过测量数据的标准偏差、测量次数及所要求的置信水平按统计学计算方法进行；不确定度的B类评定是借助可利用的相关信息，进行科学的分析判断得到B类不确定度。将定值不确定度与均匀性评估、稳定性评估引入的不确定度按照平方和开方的方法叠加就给出合成标准不确定度uCRM，该合成标准不确定度乘以包含因子k得出的不确定度称为扩展不确定度UCRM。

2.8 定值结果 标准物质的定值结果表示为标准值±扩展不确定度。

2.9 临床试用 25家试用单位在检测日常临床样本时，将试用的非洲猪瘟病毒标准物质进行荧光定量PCR或者数字PCR检测，一次检测2管标准物质，每管重复检测3次，利用试用标准物质对日常临床样品进行标定。严格按照产品的说明书对标准物质、临床样本进行标准荧光定量PCR或者数字PCR定量检测。

3 结果

3.1 质粒pUC19-P72的构建 对感染ASFV的病死猪病料组织研磨液进行核酸提取，并使用非洲猪瘟病毒P72基因全长序列扩增引物进行PCR扩增，获得ASFV的P72基因全序列。PCR产物扩增结果如图1所示。将扩增产物经过BamH I和EcoR I双酶切后，连接入pUC19载体。经过PCR鉴定、酶切鉴定和测序证明载体pUC19-P72构建成功，酶切结果如图2所示。公司测序结果显示，插入的P72基因序列长度为1 941个碱基，与我国非洲猪瘟病毒分离株ASFV-SY18同源性100%。

图1 PCR产物扩增结果

图2 pUC19-P72质粒双酶切鉴定结果

3.2 质粒pUC19-P72的纯度分析 对提取的pUC19-P72质粒的纯度和浓度进行了4次重复测定，结果显示，pUC19-P72质粒的A260/280值均在1.9左右，A260/230值均大于2，质粒浓度的均值为179.75 ng/μL，说明质粒的纯度良好，满足实际使用要求。

3.3 均匀性检测结果 统计随机抽取的30管样品，进行的90次检测数据。根据自由度(v1,v2)及给定的显著性水平α，可由表查临界值的F值，算得F

表1 均匀性检测结果

3.4 稳定性检测结果

3.4.1 长期稳定性评估结果 长期稳定性评估则是测试标准物质在长期储存条件下(-20 ℃)的稳定性，分别在第1，2，4，6，9，12个月对标准物质进行稳定性评估。结果与分析：对非洲猪瘟病毒标准物质的-20 ℃贮存条件下稳定性结果进行分析，|β1|

表2 长期稳定性结果

3.4.2 短期稳定性评估结果 标准物质在4 ℃、25 ℃、37 ℃环境下存放30 d、15 d、9 d分别进行了回归分析，|β1|

表3 短期稳定性结果

3.5 标准物质的定值结果 委托9家实验室采用数字PCR方法对标准物质的特性值进行测量，非洲猪瘟病毒标准物质的标准值为5.78×103拷贝/μL。

3.6 不确定度的评定

3.6.1 均匀性引入的不确定度 均匀性引入的不确定度包括试剂盒的精密度，仪器的精密度和人员操作所引入的不确定度，为A类不确定度。标准物质均匀性产生的标准偏差Sbb为1.12×102拷贝/μL，相对标准不确定度urelbb=2.1%

3.6.2 稳定性引入的不确定度 标准物质稳定性引入的不确定度也涵盖了储存温度的变动性对标物的影响、试剂盒稳定性引入的不确定度和人员操作引入的不确定度，为A类不确定度。暂定产品有效期为12个月，则有效期t=12个月的稳定性不确定度贡献为：s(β1)=14.1拷贝/μL；us=1.7×102拷贝/μL；相对标准不确定度urels=3.1%。

3.6.3 定值过程引入的不确定度 由定值测量重复性引入的不确定度u(A)由测量的相对标准偏差计算。u(A)=3.17E+02拷贝/μL；相对标准不确定度urel(A)=5.5%。

不确定度的B类评定是根据有关的信息或经验，判断被测量的可能值区间，假设被测量值的概率分布，根据概率分布和要求的概率确定B类不确定度为2.0%。

3.6.4 标准值的不确定度评定 合成上述标准物质的不确定度分量，取扩展因子k=2，计算扩展不确定度。非洲猪瘟病毒标准物质的扩展不确定度：UCRM=2×4.16 E+02=8.32E+02拷贝/μL。

3.7 定值结果的表示 标准物质的定值结果表示为(5.8±0.9)×103拷贝/μL。

3.8 试用结果 委托25家兽医检测实验室对非洲猪瘟病毒标准物质进行了试用，试验结果表明该产品均一性良好、量值的准确度高、产品质量稳定，与动物样本的互通性良好。

3.9 评审结论 制备的非洲猪瘟病毒标准物质满足了国家二级标准物质的要求，通过全国标准物质管理委员会的评审。

4 讨论

猪感染非洲猪瘟病毒后抗体产生的时间较晚，通常在感染7-9 d后才能血清出现阳转，而在感染48 h后就能检测到非洲猪瘟病毒核酸的存在。因此，在非洲猪瘟病毒的检测方法中，与其他检测方法相比，核酸扩增技术更为方便、快捷和准确，对于非洲猪瘟的早期诊断意义重大。除此之外，由于核酸扩增技术具有较高的特异性和敏感性，不仅可以检测猪的唾液、血清、血浆、组织、细胞培养物，还可以对环境样品、排泄物、饲料、食品等多种类型样品进行检测[6-7]，使得核酸检测的应用范围更加广泛。根据中国动物疫病预防控制中心公布的第2次非洲猪瘟现场快速检测试剂评价名单，通过专家评审的34种非洲猪瘟检测试剂盒全部为采用核酸扩增技术的产品，其中荧光定量PCR类28种，等温扩增类6种[8]。

鉴于非洲猪瘟病毒感染猪的特性以及当前我国非洲猪瘟流行和检测的现状，迫切需要一种非洲猪瘟病毒标准物质，从而满足养殖环节、流通环节、屠宰环节非洲猪瘟病毒诊断的使用需求。因此本研究中研制的标准物质按照《标准物质定值的通用原则及统计学原理》(JJF1343-2012)对标准物质进行了均匀性和稳定性评估。均匀性评估分别对样品内和样品间进行了检测，稳定性评估分别对-20 ℃、4 ℃、25 ℃和37 ℃的保存效果进行了评估，结果显示，本标准物质的均匀性和稳定性都能够满足相关要求。通过多家实验室的临床试用，该产品均一性良好、量值的准确度高、产品质量稳定，与动物样本的互通性良好。综上所述，本研究制备的标准物质通过评价满足了国家二级标准物质的要求，最终通过了全国标准物质管理委员会的评审。

本试验中研发的非洲猪瘟病毒标准物质可用于检测非洲猪瘟病毒的实验室校准、建立计量溯源性、为其他材料赋值、测量方法/程序的确认，实验室内或实验室间质量控制量值传递、评价和控制测试方法、实验室质量控制等用途。本标准物质的成功研制为促进非洲猪瘟病毒的核酸检测水平的提高，为保障农产品质量安全和非洲猪瘟净化提供了有效的工具，具有重大的经济效益和社会效益。