3种止痢型中兽药液体制剂中非法添加黏菌素的HPLC-PDA检查方法的建立

2019-04-16 07:30韩宁宁于晓辉董玲玲杨秀玉万仁玲
中国兽医杂志 2019年9期
关键词:小檗菌素口服液

韩宁宁 , 刘 畅 , 于晓辉 , 范 强 , 赵 晖 , 董玲玲 , 杨秀玉 , 万仁玲

(1.中国兽医药品监察所 , 北京 海淀 100081;2.华南农业大学 , 广东 广州 510642)

黏菌素,又称多黏菌素,是从多黏杆菌培养液中分离出的一种多组分的多肽类抗生素。由于黏菌素对革兰阴性杆菌(大肠埃希菌等)引起的肠道感染具有良好的治疗效果,有不法中兽药制剂生产企业将其添加于用于止痢的口服液或注射液中,以增强疗效。该处方外非法添加行为严重扰乱了兽药市场秩序,影响了畜产品质量安全,应予以制止与惩戒。但由于黏菌素在《中国兽药典》中含量测定方法为效价法,目前仍没有针对止痢型中兽药液体制剂中非法添加黏菌素的检查方法。本研究旨在建立一种简便准确的高效液相色谱法,以实现对止痢型中兽药液体制剂中添加黏菌素进行定性定量检测。

1 仪器与试剂

1.1 仪器与设备 高效液相色谱仪,Waters2695,配二极管阵列检测器2998(PDA);电子天平AX205,梅特勒-托利多。

1.2 药品

1.2.1 黏菌素对照品 批号/来源/含量:K0271305/中国兽医药品监察所/22782单位/mg。

1.2.2 空白止痢型中兽药液体制剂 杨树花口服液(来源/批号/规格:佛山市南海禅泰动物药业有限公司/161003/1 mL相当于原生药1 g);板蓝根注射液(来源/批号/规格:江西鑫维药业有限公司/20151201/1 mL相当于原生药0.5 g);小檗碱注射液(来源/批号/规格:长沙拜特生物科技研究所有限公司/20151201/10 mL:0.1g)。

1.3 试剂 乙腈,色谱纯,德国Merck公司;硫酸钠、磷酸,分析纯,国家集团化学试剂有限公司。

2 方法

2.1 色谱条件 采用Waters HSS T3C18色谱柱,250×4.6 mm,5 μm。流动相为乙腈∶硫酸钠磷酸水溶液(20∶80),硫酸钠磷酸水溶液∶硫酸钠水溶液(7 g/L):磷酸水溶液(6.8%)(50.5∶22.75)。采集波长200~400 nm,分辨率1.2 nm,提取波长215 nm。流速1.0 mL/min。进样量20 μL。柱温30 ℃。

2.2 溶液配制

2.2.1 制剂空白溶液 分别取杨树花口服液、板蓝根注射液、小檗碱注射液1 mL,置100 mL容量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀即得。进样前用0.45 μm滤膜过滤。

2.2.2 专属性溶液 分别取杨树花口服液、板蓝根注射液、小檗碱注射液1 mL,置100 mL容量瓶中,分别加黏菌素标准品20 mg,加水稀释至刻度,摇匀即得。进样前用0.45 μm滤膜过滤。

2.2.3 检出限溶液 将黏菌素标准品用水溶解配制为2 mg/mL的母液。取杨树花口服液1 mL,置100 mL容量瓶中,加上述母液5 mL,加水稀释至刻度,摇匀即得;取板蓝根注射液1 mL,加上述母液 2 mL,加水稀释至刻度,摇匀即得;取小檗碱注射液1 mL,加上述母液2 mL,加水稀释至刻度,摇匀即得。进样前用0.45 μm滤膜过滤。

2.2.4 线性溶液 将黏菌素标准品用水溶解配制为2 mg/mL的母液,作为线性溶液⑤。分别取上述母液 1 mL、5 mL、5 mL、5 mL分别置50 mL、50 mL、25 mL、10 mL容量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀得线性溶液①、②、③、④。

2.2.5 回收率溶液 取杨树花口服液、板蓝根注射液、小檗碱注射液各1 mL,分别置100 mL容量瓶中,加黏菌素标准品20 mg,加水稀释至刻度,摇匀即得。进样前用0.45 μm滤膜过滤。

3 结果

3.1 专属性 板蓝根注射液本底对黏菌素E1及E2色谱峰均无影响;杨树花口服液及小檗碱注射液本底均有色谱峰与黏菌素E2重合,但对E1无影响。故选取黏菌素E1峰作为目标峰。黏菌素标准品溶液色谱图及三种制剂空白溶液色谱图见图1~图4。

图1 黏菌素标准品色谱

图2 板蓝根注射液制剂空白溶液色谱

图3 杨树花口服液制剂空白溶液色谱

图4 小檗碱注射液制剂空白溶液色谱

3.2 标准曲线及线性范围 以峰面积为(y)为纵坐标,相应浓度(x)为横坐标,绘制标准曲线,得回归方程为y=2.9E6x-20762,相关系数R2=0.9999,表明黏菌素E1在0.04~2 mg/mL浓度范围内线性关系良好。

3.3 检出限 将PDA光谱图平滑无锯齿状波动,且纯度角度大于纯度阈值、PDA匹配角度大于PDA匹配阈值作为检出限评定标准,得3种制剂检出限分别为:板蓝根注射液4 mg/mL、小檗碱注射液4 mg/mL、杨树花口服液10 mg/mL。

3.4 回收率 3种止痢型中兽药液体制剂中黏菌素的添加回收率为95.9%~97.9%,RSD为0.9%~1.8%,表明该方法回收率良好,准确度符合《中国兽药典》兽药质量标准分析方法验证指导原则[3]的要求。见表1。

表1 3种止痢型中兽药液体制剂中黏菌素E1添加回收率

4 讨论与小结

4.1 止痢型中兽药液体制剂的选择 止痢型中兽药液体制剂,除本方法建立中使用到的杨树花口服液、板蓝根注射液、小檗碱注射液外,还有双黄连口服液、双黄连注射液、金芩芍注射液等。但后3种制剂即便与微量黏菌素混合亦会产生絮状沉淀,分析可能是黏菌素的酸性成分使制剂中的蛋白类成分发生变性所致。故后3种制剂不可能存在处方外非法添加黏菌素的可能,因而本研究选择了上述前3种液体制剂作为供试品空白制剂。

4.2 色谱方法中流动相及检测波长的选择 本方法所选用的流动相系统参考了文献[4]:乙腈∶硫酸钠水溶液(7g/L):磷酸水溶液(6.8%)(22.25∶50.5∶22.75),并对该系统中有机相与水相的比例进行了细微调节,以使上述3种中兽药制剂的本底色谱峰均可与黏菌素E1峰实现良好分离。另外,文献[4]选取的提取波长为205 nm,虽然与215 nm比较,205 nm下黏菌素E1的紫外吸收强度更强,但中兽药制剂的本底色谱峰干扰亦更强。为保证黏菌素E1与本底色谱峰的良好分离,选取干扰更低的215 nm作为提取波长。

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