不明原因的自发流产与精子DNA损失的关系

刘成军 涂艳琴 王蔼明 商 微 王伟周 李 敏 沈玉良

1 肇庆市西江医院生殖中心(肇庆526000)2 海军总医院生殖中心(北京100048)

自发性流产在正常生育人群中占10%～15%，而在生育力低下的人群中所占比例更高[1]。目前，自发性流产的患者呈上升趋势，其中将近50%为不明原因流产。这些不明原因流产患者夫妻双方染色体核型分析正常，并且女方身体不存在解剖异常，其内分泌水平也在正常范围内，自身免疫系统没有明显异常，不存在生殖道感染等常见疾病；而根据世界卫生组织标准对男性精液的精子浓度、形态和活力检查也不存在异常。这些患者本身能怀孕，也说明了男方精子不存在数量不足、活力低下等问题。精子DNA损伤的是男性不育的一项新标准，很多医院将这一项检查纳入了男性精子必查项目。精子DNA完整性对卵子受精、胚胎发育特别是8细胞以后的发育和着床等都是一个重要的影响因素[2]。有文献报道，精子DNA损失与复发性流产有关，可能是其原因之一[ 3]。2011年，我们的临床统计结果也认为精子DNA损失与复发性流产有一定关系[4]。目前，患者的就医意识增强了，一般患者第一次流产后就会就医，本研究比较流产一次的夫妻和正常夫妻男方精子DNA损失有无差异。

1 资料与方法

1.1 研究对象

通过对门诊病历的筛选，收集了31例有一次不明原因流产史的患者最为试验组。试验组纳入标准是夫妻双方染色体核型分析结果均为正常且均无家族遗传病，没有自愿人工流产史。同时女方无解剖及内分泌异常，没有生殖道炎症等常见病因。同时收集33例无流产史的患者作为对照组。对照组纳入标准为夫妻有正常妊娠史，其中男性精液常规检查无明显异常。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂：主要用到的仪器是重庆光学仪器厂出产光学显微镜(型号为XSZ-HS7)。精子DNA损伤检测试剂购自西班牙Halotech公司开发的试剂盒，主要包括凝胶、瑞氏染色液、细胞裂解液和细胞酸性变性等。

两组的精液量、精子密度及活力均无差异，实验组男方年龄(32.52)小于对照组(34.03)，有差异(P=0.03)，但实验组的DFI(27.10)要高于对照组(22.25)，差异有统计学意义(P=0.002)。见表1。

表1精子DFI与流产的关系

2 讨 论

和普通的体细胞相比，由于精子中的大部分组蛋白被鱼精蛋白替换，其DNA高度致密化，增加了遗传物质的稳定性。精子DNA链损伤可能会造成其功能缺失, 损伤机理主要有以下三种：第一，在精子形成过程中，染色质凝集不完全，特别是鱼精蛋白的缺失，会造成精子DNA不稳定，导致DNA损伤。在动物模型中，敲除鱼精蛋白基因后鱼精蛋白缺失，精子DNA损伤，而且精子受精能力下降[6]。而在不育的男性中，约有5%～15%的男性缺乏鱼精蛋白[7]。第二，细胞凋亡异常也许是引起的精子DNA损伤的一个原因，但这种观点还存在争议[8]。在精子发生过程中，75%以上的精子发生凋亡。这种选择性的凋亡程序使得部分早期精子避免了凋亡，而不正常的精子一般都会发生凋亡[9]。Sakkas[8]等人认为可能某些DNA损伤的精子逃避了凋亡，这样使得精液中的精子DNA损伤精子的比率有所增加。生精细胞表面上的Fas 蛋白结合可以与其配体(FasL) 结合，从而启动生精细胞的凋亡程序。正常生育男性中Fas 阳性精子比异常者Fas 阳性精子少，说明这些人群中生精细胞清除DNA 受损精子的功能可能存在异常[10]。精子凋亡异常引起DNA 损伤精子比例增加也可能与半胱天冬酶(caspase) 激活有关[11]。McVicar[12]等人研究在射出体外的精子中凋亡标记物时发现，生育男性的精子未发现携带Fas，而畸形精子症及弱精症等精子参数异常的男性精子Fas 阳性率则较高。第三，氧化应激反应(oxidative stress)。正常生理浓度的活性氧(reactive oxygen species，ROS) 有利于精子的正常功能，但高浓度的活性氧可能导致精子DNA 单链或双链部分断裂从而造成DNA损伤，研究发现大约有25%～40%不育患者精液中存在高水平活性氧[13]。适当的氧化反应对精子功能有益，但过量的氧化反应对精子DNA会产生损伤。这是造成精子DNA损伤的一个重要原因[14]。

精子DNA损伤检测方法有很多种，常用的有精子染色质结构分析(SCSA) 、精子染色质扩散分析(SCD)。精子DNA检测一个重要的意义就是为男性不育提供参考，为助孕治疗提供参考。与正常男性相比，不育男方的精子DNA损伤较高[15]。但不同方法的检测结果阈值不同，还没有一个统一的标准。精子染色质结构分析(sperm chromatin structure assay, SCSA)被公认为检测精子DNA损伤的“金标准”，其检测结果客观、准确度高，但SCSA操作方法不便，且需要流式细胞仪等较昂贵的设备。Fernández等人发明了利用精子染色质扩散实验检测精子DNA损伤，这种方法操作相对简单，不需要昂贵设备，一般医疗机构都有条件开展[5]。而且通过对比SCD与SCSA两种检测方法发现两者有很高的一致性，这说明了SCD方法检测精子DNA损伤同时具备结果准确可靠和费用低廉的优点[5]。

Bungum等运用SCSA法检测精子DNA时发现当DFI > 30 %时， 人工授精的妊娠概率接近于零[16]。此外, 利用TUNEL 法评估精子DNA损伤发现，当DFI>12 %时不能正常妊娠，DFI在10%～12%之间会导致流产[17]。因此，在人工授精中DFI具有较好的评估预后作用。但有关精子DNA损伤与IVF/ICSI结局的关系尚无定论。Morris等认为精子DNA损伤比例增加与IVF 失败相关[18]。而Ahmadi等研究发现，精子DNA损伤比例高的患者的受精率和正常人群没有明显差异，但囊胚形成率明显降低并影响胚胎种植[19]。对最近的研究做比较分析可以看出，精子DNA损伤对辅助生殖结局存在一定的影响，但具体对什么产生影响，现在还没有共识。存在这些分歧一方面是由于样本量较小，另一方面可能是由于精子DNA损伤检测方法不同；另外受精的过程中，本身就有一个选择精子的过程，DNA受损的精子获得受精存在一定的几率，这样结果可能就有较大差异。

从理论上讲，胚胎发育到第三天的时候基因组被激活，父源基因开始起作用，如果DNA损伤严重，胚胎自身无法修复，这样可能会导致胚胎发育潜力下降，囊胚形成率降低；甚至可能影响妊娠率，也可能引起流产。 有人研究发现高DFI与流产率有密切关系，行ICSI授精术的患者中高DFI组流产率显著增加(P=0.009)。 Evenson等人采用SCSA方法检测精子DNA，结果发现随着DFI的增加妊娠几率降低。而且在流产患者中，高DFI占39%[20]。近年，有多篇报道均精子DNA损失与习惯性流产有关，精子DNA损失率越高，流产的风险越大[21]。

但以上研究多以复发性流产患者为研究对象，还没有人比较研究精子DNA损失与一次不明原因流产的关系，本研究就此做了对比研究。一般情况下，随着男性年龄的增加DFI呈增高的趋势[22]， 本研究结果发现对照组男方年龄显著高于实验组，但自发流产患者男性配偶的DFI明显高于正常组。这更能说明不明原因的自发流产与男方精子DFI密切相关，随着DFI的增加，流产风险增加。因此，对于流产的夫妇，男方精子DNA损失的检测很有必要，不仅仅是复发性流产，对任何自发流产的患者都有必要检查男方精子DNA的损失。

引起精子DNA损伤的原因有很多，如化疗、放疗，还有环境因素、生活节奏的加快、饮食、吸烟、酗酒等等。患有癌症的年轻男性即使在癌症治疗前精子质量也会较差，精子DNA损伤严重。癌症患者运用化疗或者放疗后，随着药物剂量的累积和放疗时间的积累，会导致绝对的不育，说明目前化疗药物对生精功能有毒害[23]。放化疗同样会导致睾丸生精功能受损、精子DNA损伤增加[24]。男性生殖管道感染和炎症(如附睾炎等)会导致白细胞增加进而引发白细胞精子症，氧化应激反应增多，并由此造成精子DNA损伤增加[25]。据报道感染支原体和衣原体的男性，往往会导致精液质量下降，并且精子DNA损伤率增加，妊娠率下降[26]。

综述所述，本研究结果与其他研究结果相符，精子DNA损伤会影响胚胎的发育潜力并增加流产风险。