长链非编码RNA ERVH48-1在膀胱癌中的表达及对膀胱癌细胞增殖和迁移的影响

杨金辉 胡海龙 孙建涛 郝彤彤 李小辉 张 寒

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，其发生率呈逐年上升趋势，然而其确切的发病机制尚不明确[1]。长链非编码RNA(long-chain non-coding RNA，lncRNA)是长度大于200个nt的不具有编码蛋白功能的RNA，具有组织特异性[2]。lncRNA参与调控细胞的增殖、分化、凋亡等方面有关，近年的研究成果表明lncRNA与多种恶性肿瘤的形成密切相关[3]。越来越多的lncRNA被发现与膀胱癌的发生、发展、转移等密切相关[4]。ERVH48-1是一个全新的lncRNA，在疾病特别是肿瘤中少有报道。本研究通过检测ERVH48-1在膀胱癌组织和细胞株中的表达水平，观察ERVH48-1与膀胱癌发生、发展的相关性。选取表达水平最低的膀胱癌细胞，向细胞株内转染ERVH48-1质粒，观察细胞株增殖、迁移和下游基因表达的改变，探讨ERVH48-1对膀胱癌细胞生物学行为的影响和可能的作用机制。

材料与方法

1.材料:选取笔者医院泌尿外科2017年2月～2017年11月收治的膀胱癌患者16例，所有患者术前均未接受过化学治疗、放射治疗、生物免疫治疗，所有组织标本均经病理证实，本研究经笔者医院伦理学委员会批准，所有患者均签署知情同意书。膀胱癌细胞(BIU87、T24、5637、UM-UC-3)和正常膀胱上皮细胞(SV-HUC-1)购自中国科学院上海细胞库。LipofectamineTM3000购自美国Invitrogen公司。长链非编码RNA ERVH48-1 质粒和阴性对照质粒购自上海吉玛制药技术有限公司。DMEM高糖培养基、RPMI 1640培养基和胎牛血清购自美国Hyclone公司。Transwell小室购自美国康宁公司。荧光定量 PCR 试剂盒和噻唑蓝(methyl thiazol tetrazolium，MTT)试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。一抗TCF21、CDK4、CDK6、Cyclin D1、N-cadherin、Vimentin和α-Tubulin购自美国Cell Signaling Technology公司。ECL显影液购自美国Thermo公司。辣根过氧化物酶标记的二抗购自武汉博士德生物有限公司。

2.细胞培养与转染:在37℃、5%CO2的培养箱内，使用含10%胎牛血清和1%双抗的RPMI-1640培养基培养膀胱癌细胞BIU87、T24和5637，使用含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM高糖培养基培养膀胱癌细胞UM-UC-3和正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1。在转染前1天，将5637细胞使用不含双抗的培养基重悬后接种到6孔板中，当细胞融合度达到60%时，根据LipofectamineTM3000转染试剂说明书进行转染，分别转染ERVH48-1质粒(实验组)和阴性对照质粒(对照组)，lncRNA的终浓度为15nmol/L。18h后吸去培养基，加入新鲜培养基继续培养。

3.荧光实时定量PCR检测 ERVH48-1、TCF21 mRNA的表达量:采用TRIzol法提取组织和细胞的总RNA，检测RNA浓度和纯度，反转录为cDNA。以GAPDH为内参，采用荧光定量PCR试剂盒检测组织和细胞中ERVH48-1或TCF21 mRNA 的表达水平。反应条件为：94℃ 10min、60℃ 1min、72℃ 1min，35个循环。实时定量PCR引物序列详见表1，每个样品设置4个复孔，检测得到的荧光信号值采用2-ΔΔCt方法进行统计分析。

表1 实时定量PCR引物序列

4.MTT法检测高表达ERVH48-1对5637细胞增殖能力的影响:实验组细胞转染ERVH48-1质粒，对照组细胞转染阴性对照质粒，24h后收集细胞，调整细胞密度重铺至96孔板(4000个/孔)，每组设置4个复孔，在培养箱内连续培养5天。在每天的检测时间点，每孔分别加入20μl MTT试剂，在培养箱内孵育4h后，吸净孔内培养基，每孔加入100μl二甲基亚砜，96孔板在摇床上振荡15min，在酶联免疫检测仪上检测各孔在490nm波长处的吸光度(A)值，绘制生长曲线。

5.Transwell实验检测高表达ERVH48-1对5637细胞迁移能力的影响:转染48h后消化收集各组5637细胞，使用无血清培养基重悬细胞，细胞计数并调整细胞浓度至2×105/ml，取200μl细胞悬液加入上室，下室内加入600μl含10%胎牛血清的培养基，培养箱内连续培养18h后。使用PBS溶液清洗Transwell小室，使用95%甲醇固定20min，使用0.3%结晶紫染液染色20min，使用PBS溶液清洗，使用棉签擦去未穿过滤膜的细胞。显微镜计数穿过滤膜的细胞，以4个视野的细胞平均数为准。

6.Western blot法检测高表达ERVH48-1对5637细胞相关蛋白表达的影响:转染48h后消化收集各组5637细胞，使用PBS溶液洗涤细胞，提取总蛋白。蛋白样品经10%SDS-PAGE跑胶后转膜电至PVDF膜上。各组蛋白样品经SDS-PAGE电泳后，电转至PVDF膜，室温下使用含5%牛血清白蛋白的封闭液封闭3h，4℃下分别与一抗TCF21、CDK4、CDK6、Cyclin D1、N-cadherin、Vimentin和α-Tubulin孵育过夜，洗膜后室温下与二抗孵育3h，洗膜后滴加ECL显影液显影。

结 果

1.膀胱癌组织和癌旁组织中ERVH48-1的表达量:膀胱癌组织和癌旁组织中ERVH48-1的表达量分别为1.65±0.23和5.41±0.40，膀胱癌组织中ERVH48-1表达量明显低于癌旁组织(P<0.01，图1)。

图1 膀胱癌组织和癌旁组织中ERVH48-1表达水平检测与癌旁组织比较，*P<0.01

2.膀胱癌细胞和正常膀胱上皮细胞中ERVH48-1的表达量：与SV-HUC-1正常膀胱上皮细胞比较，膀胱癌细胞中的ERVH48-1表达量明显降低，膀胱癌细胞BIU87、T24、5637、UM-UC-3和正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1中ERVH48-1的表达量分别为0.60±0.04、0.36±0.04、0.17±0.03、0.78±0.02和1.01±0.07，膀胱癌细胞株中ERVH48-1表达量均低于正常膀胱上皮细胞(P<0.05)。其中5637细胞中ERVH48-1的表达水平最低(P<0.01，图2)。

图2 正常膀胱上皮细胞和膀胱癌细胞中ERVH48-1表达水平检测与SV-HUC-1细胞比较，*P<0.05，**P<0.01

3.各组5637细胞中ERVH48-1的表达量:转染48h后收集各组5637细胞，对照组和实验组5637细胞中ERVH48-1表达量分别为1.01±0.06和6.27±0.44，实验组明显高于对照组(P<0.01)，ERVH48-1质粒使细胞中ERVH48-1的表达明显增加(图3)。

图3 实验组和对照组5637细胞中ERVH48-1的表达量与对照组比较，*P<0.01

4.高表达ERVH48-1抑制5637细胞的增殖能力：通过MTT法连续5天检测各组5637细胞的增殖能力，以时间(天)为横轴、吸光度(A)值为纵轴绘制生长曲线。与对照组比较，从第3天起，实验组细胞增殖能力明显受到抑制(P<0.05，图4)。

图4 MTT检测各组膀胱癌细胞增殖能力与对照组比较，*P<0.05

5.高表达ERVH48-1抑制5637细胞的迁移能力：Transwell实验检测各组5637细胞的迁移能力。实验组和对照组5637细胞穿过滤膜细胞数分别为69.74 ± 17.95和192.20 ± 27.56，表明ERVH48-1能够抑制5637细胞的迁移能力，差异有统计学意义(P<0.01，图5)。

图5 Transwell实验检测ERVH48-1对膀胱癌细胞迁移能力的影响与对照组比较，*P<0.01

6.高表达ERVH48-1促进膀胱癌5637细胞中TCF21 mRNA的表达:荧光实时定量PCR检测各组5637细胞TCF21 mRNA的表达水平，结果显示，实验组和对照组5637细胞TCF21 mRNA的表达分别为9.97±0.74和1.01±0.06， ERVH48-1能够促进TCF21 mRNA的表达(P<0.01)。

7.高表达ERVH48-1对膀胱癌5637细胞下游蛋白表达的影响:Western blot法检测各组5637细胞下游蛋白的表达，结果显示高表达ERVH48-1诱导TCF21蛋白表达升高，TCF21蛋白表达升高引起细胞增殖相关蛋白CDK4、CDK6、Cyclin D1表达明显降低，细胞迁移相关蛋白N-cadherin、Vimentin表达明显降低(图6)。

图6 Western blot法检测ERVH48-1下游蛋白表达水平

讨 论

长链非编码RNA(long-chain non-coding RNA，lncRNA)是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA，广泛分布于真核细胞的细胞质和细胞核内[5]。lncRNA可在转录后水平通过多种方式如加帽、加尾、选择性剪接促进或抑制下游基因的表达[6]。近年来研究表明，大量lncRNA在正常组织和肿瘤组织中存在异常的差异性表达，lncRNA在肿瘤的发生、发展过程中可能起着抑癌作用[7]。膀胱癌的发生、发展过程中受到很多lncRNA的调控，MALAT1、XIST可促进膀胱癌细胞的增殖和转移，HULC、DUXAP10、SNHG16可促进膀胱癌细胞的增殖[8～12]。目前有关长链非编码RNA ERVH48-1在肿瘤中的作用未见报道。

本研究通过检测ERVH48-1在膀胱癌组织和膀胱癌细胞株中的表达水平，发现ERVH48-1在膀胱癌组织和膀胱癌细胞株中表达水平下调，提示ERVH48-1可能在膀胱癌中发挥类似抑癌基因的作用。本研究通过转染实验证明了高表达ERVH48-1能够抑制膀胱癌细胞的增殖和迁移，说明ERVH48-1可能通过抑制增殖和迁移调控膀胱癌的形成，这对于揭示膀胱癌的发生、发展机制具有重要意义。转录因子21(TCF21)基因定位于6q23-q24，是一种新发现的抑癌基因[13]。TCF21在多种肿瘤如肺癌、乳腺癌、肾癌等中表达明显下调，可显著抑制肿瘤细胞的增殖和迁移能力，且与患者的低生存率明显相关[14～16]。有研究显示，TCF21在膀胱癌中的表达水平明显降低[17]。本研究发现，高表达膀胱癌细胞中ERVH48-1的表达后，TCF21基因在mRNA和蛋白的表达水平明显升高。TCF21蛋白表达升高后，细胞增殖相关蛋白CDK4、CDK6、Cyclin D1表达明显降低，细胞迁移相关蛋白N-cadherin、Vimentin表达明显降低，与细胞功能实验结果一致。长链非编码RNA ERVH48-1调控TCF21基因的分子机制和信号通路是本研究下一步研究的重点。

综上所述，长链非编码RNA ERVH48-1在膀胱癌中低表达。高表达ERVH48-1可明显抑制膀胱癌细胞的增殖和迁移，其作用机制可能通过促进抑癌基因TCF21的表达。ERVH48-1可能为膀胱癌的诊治提供新的治疗靶标和分子标志物。