原料乳体细胞数对硬质干酪蛋白水解及风味与质构品质的影响

穆 硕，刘鑫宇，罗 洁，任发政，李 博，王 娜，张永祥，葛克山,*

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，教育部北京市共建功能乳品重点实验室，北京 100083；2.河北省畜产食品工程技术中心，河北 三河 065200）

硬质干酪是向原料乳（牛乳、羊乳、水牛乳等）中添加发酵剂、凝乳酶之后，经发酵、排乳清、盐搓、压榨、成熟等工艺制作而成的一种干酪，因其独特的质地风味与极高的营养价值而深受消费者的喜爱[1]。风味是影响消费者选择干酪的重要因素，干酪中的风味物质主要在干酪的成熟过程中通过糖酵解、脂肪分解和蛋白质水解产生。蛋白质水解包括蛋白质降解为游离氨基酸和游离氨基酸降解为风味物质两步，参与该过程的酶主要有3 个来源：天然存在于牛乳中的蛋白酶、微生物来源的内源性蛋白酶和添加的外源性蛋白酶。

在中国，自由放养和小规模奶牛养殖仍占有一定比例[2]，在这些养殖场中手动挤奶的方式会使体细胞混入原料奶中，包括上皮细胞、巨噬细胞、多核中性粒细胞（polymorphonuclears，PMNs）以及淋巴细胞[3]。在健康的牛乳中，巨噬细胞占35%～79%[4-5]、PMNs占3%～26%[6]、淋巴细胞约占16%～28%[7]，上皮细胞随着泌乳过程从乳腺脱落进入牛乳当中，在健康牛乳中的数量较低，有时不能被检测出来[3]。体细胞组成及数量对干酪品质具有重要影响。

关于体细胞数（somatic cell count，SCC）对干酪品质的影响已有大量研究，已有的研究结果表明，在全脂干酪体系下，高SCC会对硬质干酪造成游离脂肪酸增加、产生腐臭和脂肪氧化的味道、降低感官评分等不利影响[8-12]，但他们只关注了原料乳中体细胞的数量而并未解析体细胞组成，这些研究结合感官评价结果和游离脂肪酸测定结果，认为体细胞对脂肪降解的影响主导着干酪的感官评分，但他们并未测定干酪的挥发性风味物质变化。事实上蛋白质的水解也是风味形成的一个重要过程，鲜有研究在脱脂干酪体系下排除脂肪的干扰，单独探讨体细胞主导的蛋白水解对干酪风味物质的影响。

本研究采集了3 种不同SCC牛乳，解析其体细胞组成，并将其制作成脱脂契达干酪，通过测定干酪在成熟期的蛋白酶活力、蛋白水解程度及成熟后的挥发性风味物质含量和质构特性来探究SCC通过蛋白水解对干酪品质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料乳选用正常乳和隐形乳房炎乳，取自河北福成奶牛场，原料乳均从工厂中的鲜奶贮藏罐取样以排除奶牛个体间差异。

Mouse Anti Bovine CD11b（FITC）、Mouse Anti Bovine CD14（FITC） 美国Bio-Rad公司；Anti-Cytokeratin 18 Antibody（FITC） 英国Abcam公司；CD5 Antibody（Alexa Flour 488） 美国Nouvus Biologicals公司；R704直投式发酵剂、Stamix 1150凝乳酶 中国科汉森公司。

1.2 仪器与设备

Fossmatic5000体细胞检测仪 丹麦FOSS公司；FACS AriaIII流式细胞仪 美国BD Biosciences公司；气相色谱-质谱联用（gas chromatography/mass spectrometer，GC-MS）仪（配有电子轰击离子源及MassHunter数据处理分析系统） 美国Agilent公司；固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）头（50/30 μm DVB/CAR/PDM）、DB-WAX色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国色谱科公司；TMS-Pro型质构仪 美国FTC公司；AR2000型流变仪美国TA公司。

1.3 方法

1.3.1 原料乳制备

原料乳在3 000×g、4 ℃条件下离心15 min脱去脂肪，收集下层，并将沉淀在离心瓶底部的体细胞刮下复添回原料乳中，使用Fossmatic 5000体细胞检测仪测定原料乳组分及SCC[13]。

1.3.2 原料乳体细胞组成测定

参考Rivas等[14]的方法，使用FACS AriaIII流式细胞仪测定原料乳中体细胞组成，使用Mouse Anti Bovine CD11b（FITC）标记PMNs[15]；使用Mouse Anti Bovine CD14（FITC）标记巨噬细胞[16]；使用Anti-Cytokeratin 18 Antibody（FITC）标记上皮细胞[17]；使用CD5 Antibody（Alexa Flour 488）标记淋巴细胞[18]。

1.3.3 契达干酪制作与指标的测定

使用质量分数为0.1%的直投式发酵剂和质量分数为0.05%的凝乳酶，参考Hu Ya’nan等[19]的方法进行干酪的制作。干酪在4 ℃条件下成熟90 d，并取成熟0 d的干酪进行水分、蛋白质量分数的测定[20]，成熟期间取0、15、30、60、90 d的样品进行各项指标的测定。

1.3.4 总蛋白酶活力的测定

选取成熟0、15、30、60、90 d的干酪，准确称取1.0 g，使用10 mL 20 g/L pH 7.0的柠檬酸三钠缓冲液进行溶解。混匀后，于37 ℃水浴中保温30 min。2 000×g离心5 min后取上清液按GB/T 23527—2009《蛋白酶制剂》[21]进行测定。

1.3.5 蛋白水解程度

1.3.5.1 可溶性氮比例的测定

选取成熟0、15、30、60、90 d的干酪进行可溶性氮（soluble nitrogen，SN）的测定。参考Andrews等[22]的方法进行pH 4.6可溶性氮（pH 4.6-SN）的测定，结果以其在总氮中的占比（pH 4.6-SN/TN）表示；参考Brandsma等[23]的方法进行质量分数12%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）可溶性氮的测定（12% TCA-SN），结果以其在总氮中的占比（12% TCA-SN/TN）表示。

1.3.5.2 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

取成熟0、15、30、60、90 d的干酪进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）实验。参考Laemmli[24]的方法，取0.75 g干酪于研钵，加25 mL pH 4.6醋酸缓冲液研磨成浆状，40 ℃保持1 h。经4 ℃、3 000×g离心30 min后取沉淀加6 mol/L尿素溶解并用BCA蛋白浓度法[25]测定蛋白质量浓度，最终将质量浓度调至1 μg/μL，并用5 倍体积的上样缓冲液（pH 6.8，60 mmol/L Tris-HCl溶液、250 g丙三醇、20 g SDS、50 mLβ-巯基乙醇）稀释后煮沸5 min，冷却备用。SDS-PAGE实验条件为：分离胶和浓缩胶分别为质量分数12%和质量分数6%的丙烯酰胺，浓缩胶电压80 V，分离胶电压120 V，凝胶经扫描仪扫描成像并用Quantity One软件进行蛋白分子定性与定量分析。

1.3.6 干酪风味的测定

参考Pinho等[26]的方法采用顶空-SPME与GC-MS技术（headspace-SPME-GC/MS，HS-SPME-GC/MS）测定干酪成熟90 d后的风味物质。取10 g干酪于研钵，加等量的无水硫酸钠研磨至粉末，迅速放入50 mL顶空瓶中并封盖，于40 ℃水浴中平衡30 min。插入SPME头，推出后于40 ℃水浴中吸附30 min，萃取头首次使用前需260 ℃老化1 h，之后每次使用前230 ℃老化10 min。完成吸附后缩回SPME头，进行GC-MS实验。GC条件：色谱柱为DBWAX；载气为氦气，流速为1 mL/min，不分流进样；进样口温度230 ℃，解吸附（溶剂延迟）时间3 min；升温程序：起始温度40 ℃，以3 ℃/min升至120 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升至230 ℃，保持2 min。MS条件：离子化模式为电子轰击；离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃；质量扫描范围m/z35～600。

1.3.7 干酪品质的测定

1.3.7.1 质构特性的测定

取成熟0、15、30、60、90 d的干酪进行质构实验，参考Hu Ya’nan等[19]的方法，使用TMS-Pro型质构仪对不同成熟期的干酪进行质构实验。样品先在室温至少放置1 h以平衡温度，再切成边长为1.5 cm的正方体进行实验，压缩形变量为样品高度的1/3。

1.3.7.2 流变特性的测定

取成熟90 d的干酪进行流变实验，参考Brickley等[27]的方法，使用AR2000型流变仪对不同成熟期的干酪进行流变实验。样品先在室温至少放置1 h以平衡温度，选用直径20 mm的铝制探头，调整间隙为2 mm，升温范围20～80 ℃，升温速度3 ℃/min。

1.4 数据统计与分析

每组实验均重复3 次并取平均值。实验数据采用Excel软件整理和制图，SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，各表中数值以表示，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 原料乳成分与体细胞组成

表1 原料乳成分与体细胞组成Table 1 Chemical composition and somatic cell composition of raw milk

原料乳中成分及体细胞组成受很多方面因素的影响，如年龄和泌乳阶段、季节、应激、奶牛管理水平等[16]。本实验将收集到的原料乳按照SCC从多到少依次分为A、B、C 3 组，其成分及体细胞组成如表1所示。3 组脱脂乳的蛋白和乳糖质量分数没有显著差异（P＞0.05）。但体细胞组成有显著差异，其中A组和B组的SCC分别为（4.03±0.60）×104个/mL和（29.30±0.70）×104个/mL；巨噬细胞是最主要的体细胞，A组和B组分别占（75.19±1.32）%和（66.22±1.27）%，这与前人的研究结果[4,14]一致；而C组的SCC显著高于A、B两组（P＜0.05），达（86.40±1.50）×104个/mL，且PMNs和上皮细胞的占比较A、B两组显著提高，分别为（38.81±0.84）%和（6.46±0.23）%。当有异物入侵乳腺或发生乳房炎时，乳腺的PMNs会大量增殖，淋巴细胞也会迁移到乳腺，导致乳中的体细胞增加，而且在乳房炎发生时，更多的上皮细胞会脱落并进入到乳中[28]。

2.2 成熟0 d的干酪组分

成熟0 d的脱脂契达干酪组分如表2所示，不同组干酪的蛋白质、水分质量分数没有显著性差异（P＞0.05），说明SCC对干酪组分没有影响。

表2 脱脂契达干酪组分（成熟0 d）Table 2 Compositions of defatted Cheddar cheese after 0 d of ripening

2.3 体细胞组成对总蛋白酶活力的影响

在大多数干酪中，蛋白质水解是成熟过程中最复杂，也是最重要的反应。凝乳酶、血纤维蛋白溶酶和微生物来源的蛋白酶水解蛋白质生成短肽、氨基酸的混合物，直接改变干酪的风味与质构[29]。在本实验中，影响总蛋白酶活力的因素有：凝乳酶残留、发酵剂、体细胞、外源微生物（非发酵剂）。由1.3.3节的干酪制作工艺和2.1节的原料乳成分可知，凝乳酶和发酵剂的添加量是一样的，且各组原料乳的菌落总数无显著差异，因此可认定不同组间总蛋白酶活力差异是由体细胞造成的。原料乳体细胞中也含有多种蛋白质水解酶，最主要的有组织蛋白酶D、B、弹性蛋白酶和血纤维蛋白溶酶酶原[15,22]。体细胞会在加工及贮藏过程中破裂，其胞内蛋白酶释放后会影响干酪成熟时蛋白质水解，进而对干酪的质构特性及风味产生影响。不同SCC原料乳制作的干酪总蛋白酶活力在贮藏期的变化如图1所示，3 组干酪的总蛋白酶活力在贮藏期均有明显的上升，且干酪中SCC越高，蛋白酶活力也越高（也包括外源污染微生物释放的蛋白酶，即SCC越高，一般微生物菌落总数也越高）。其中，C组的蛋白酶活力在贮藏期结束时远高于A、B两组，这一方面是由于C组有较高的SCC，有更多的细胞破裂释放更多胞内蛋白酶；另一方面，C组含有更高比例的PMNs，Luo Jie等[20]曾报道较高PMNs比例的原料乳制得的干酪具有更高的血纤维蛋白溶酶活性。

图1 不同体细胞组成对脱脂契达干酪蛋白酶活力的影响Fig. 1 Effect of somatic cell composition on total protease activity during cheese ripening

2.4 体细胞组成对蛋白质水解的影响

不同体细胞组成干酪成熟过程中蛋白质的SDS-PAGE图如图2所示。在干酪成熟过程中，α-酪蛋白和β-酪蛋白水解较为明显，且αs2-酪蛋白的水解尤为显著，而β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的水解不明显，这与前人的研究结果[23,30]一致。Quantity One分析结果显示，干酪成熟90 d时C组αs2-酪蛋白（3 265±56）和β-酪蛋白（12 335±53）的灰度显著小于A、B组（A组αs2-酪蛋白灰度为11 357±78、β-酪蛋白灰度为15 893±45；B组αs2-酪蛋白灰度为3 8 2 9±3 2、β-酪蛋白灰度为14 399±38）（P＜0.05），说明C组的蛋白水解作用最强，这与C组的体细胞组成有关。有研究指出，αs2-酪蛋白对于凝乳酶有较好的抵抗能力，血纤维蛋白溶酶是其主要的水解酶[31]；β-酪蛋白可以被凝乳酶和血纤维蛋白溶酶水解，其中血纤维蛋白溶酶起着非常重要的作用[32]。C组的体细胞组成中有着较高比例的PMNs以及较高的血纤维蛋白溶酶活性，所以使αs2-酪蛋白和β-酪蛋白得到较大程度的水解。

图2 不同体细胞组成脱脂契达干酪成熟过程中蛋白质水解情况Fig. 2 Effect of somatic cell composition on proteolysis during cheese ripening

可溶性氮比例是评价干酪成熟度的重要指标，当干酪蛋白质发生二级降解时，干酪中的可溶性氮含量增加。pH 4.6可溶性氮是由残留凝乳酶降解酪蛋白产生，被认为是“成熟广度”的标志[33]。12% TCA可溶性氮是由发酵剂菌株和乳中内在微生物对酪蛋白作用产生，通常含有更多的小分子肽，被认为是干酪“成熟深度”的标志[33]。体细胞组成对干酪成熟过程中可溶性氮比例的影响如图3所示。干酪的成熟广度和深度都受体细胞影响，在成熟过程中，3 组干酪的12% TCA-SN/TN和pH 4.6-SN/TN都呈现上升的趋势，且SCC越高，12% TCA-SN/TN和pH 4.6-SN/TN上升越快；C组干酪因其高SCC及高比例PMNs而使12% TCA-SN/TN和pH 4.6-SN/TN明显高于其他两组（P＜0.05）。

图3 体细胞组成对脱脂契达干酪成熟过程中可溶性氮比例的影响Fig. 3 Effect of somatic cell composition on soluble nitrogen ratio during cheese ripening

2.5 体细胞组成对干酪挥发性风味物质含量的影响

挥发性风味物质对干酪的感官特性具有重要的影响，其可在食用前被嗅闻，也可在干酪的食用过程中，在口腔温度的加热下从干酪中挥发出来并被人体感知从而产生感官体验。挥发性风味物质的形成与干酪中蛋白质的水解有很大的关系。如表3所示，A组检测到的挥发性风味物质最少，共20 种，其中包含醇类9 种、酯类2 种、醛类3 种、酮类4 种；B组检测到24 种挥发性风味物质，其中包含醇类10 种、酯类3 种、醛类6 种、酮类4 种；C组检测到的挥发性风味物质最多，有35 种，其中包含醇类12 种、酯类6 种、醛类8 种、酮类7 种。检测到的挥发性风味物质越多表示成熟程度越高，这种趋势也与2.4节中3 组干酪的12% TCA-SN/TN和pH 4.6-SN/TN的结果一致。

乙醇是葡萄糖分解和氨基酸分解代谢中常见的终产物，在3 组干酪测得的醇类中，A组以乙醇为主，这与Arora等[34]用正常牛乳进行实验获得的结果一致；B、C两组的乙醇含量减少，且醇的种类增加；C组的正己醇含量显著高于A、B两组，正己醇具有未成熟果实的青涩味，这种味道被认为是干酪中的不良风味并且与干酪蛋白的过分水解有关。

酯类、酸类和烷类物质在3 组干酪中的含量均很低，这是因为它们的生成与脂肪代谢相关，而实验所用的脱脂乳中脂肪很少甚至没有，因此与脂肪代谢相关的风味物质含量普遍较低。干酪中的醛类和酮类通常带有香气特征，对干酪的风味有很大的贡献。3-羟基-2-丁酮具有奶油味，是乳制品中常见的特征风味物质之一，其通过柠檬酸盐代谢途径经双乙酰还原生成，3 组干酪中的3-羟基-2-丁酮含量均最高，且B组的含量（（34.57±1.56）%）较其他两组更高；辛醛、壬醛和2-壬酮具有未成熟果实的青涩味和脂肪酸败味，葵醛具有肥皂味和花香味，以上物质在C组中的含量显著高于A、B两组（P＜0.05），且C组干酪中也检测到少量具有肥皂味的仲辛酮（（0.31±0.01）%）和大量具有未成熟果实的青涩气味的己醛（（6.38±0.56）%），这些物质的产生与蛋白质过分水解有关，且对干酪风味具有负面影响，这也与2.4节中C组蛋白质水解程度最高的结果一致。以上结果说明B组较高的SCC可以增加干酪特征风味物质的含量，但C组过高的SCC以及高蛋白水解程度会导致辛醛、壬醛、2-壬酮和癸醛等对干酪的风味有负面影响物质的产生。

表3 不同体细胞组成对脱脂契达干酪中的挥发性风味化合物相对含量的影响Table 3 Effect of somatic cell composition on volatile components in cheese

2.6 体细胞组成对干酪的质构和流变特性的影响

图4 不同体细胞组成对脱脂契达干酪质构和流变特性的影响Fig. 4 Effect of somatic cell composition on textural and rheological properties of cheese

本实验通过测定90 d成熟过程中干酪的硬度和弹性变化来反映不同SCC与组成对干酪质构品质的影响，结果如图4所示。在成熟过程中，3 组干酪的硬度均有下降的趋势，且A组干酪的硬度显著高于B、C两组（P＜0.05）；3 组干酪的弹性无论是在组间还是在成熟过程中均没有出现显著差异。硬度反映了干酪中保持形状的内部结合力，由2.4节结果可知，B、C两组干酪在成熟过程中αs2-酪蛋白被降解的程度较高，这会减小干酪内部酪蛋白的结合力，从而导致硬度减小。αs1-酪蛋白是蛋白网络结构的基石，干酪的弹性与干酪中完整αs1-酪蛋白的结构密切相关，其降解会削弱酪蛋白网络结构，进而影响干酪的弹性[35]。3 组干酪的弹性在成熟期没有出现显著差异，说明αs1-酪蛋白网络结构在成熟期基本没有改变，这也与2.4节中αs1-酪蛋白被降解程度低的结果一致。

本研究选用成熟90 d的干酪进行不同体细胞组成对干酪流变特性影响的研究，结果如图4c所示。干酪的储能模量（G'）会随温度升高而减小，这与酪蛋白分子间的作用力有关，当加热时酪蛋白间氢键作用力降低，进而导致G'的减小，增加干酪的黏性。当温度小于50 ℃时，在相同温度下，A组的G'最高，C组的G'最低。低G'表明凝胶网络结构中化学键的数量较少或强度较低，凝胶结构更容易被破坏。C组的高SCC及高蛋白酶活性会促进酪蛋白水解，进而使C组干酪的酪蛋白凝胶强度降低，G'降低。

3 结 论

本实验选用不同SCC的原料乳制作脱脂契达干酪，研究了不同SCC及组成干酪的蛋白质水解程度及其对干酪风味和品质的影响，结果表明较高SCC可提升干酪特征风味物质3-羟基-2-丁酮的含量，但过高SCC会因其高比例PMNs和高αs2酪蛋白水解活力而降低干酪硬度，增加不良风味物质的种类与含量。本研究为原料乳及干酪产品质量控制提供了理论依据。