薰衣草精油微乳体系的相行为、微观结构转变和清除自由基活性

宋晓秋，王丽萍，孙 月，李帅涛，张 芊，叶 琳，杨晓波，王一非*

（上海应用技术大学香料香精技术与工程学院，上海 201418）

随着国家越来越严格地限制使用各类化学合成添加剂，食品行业对天然生物活性物质的需求日趋增加。植物精油作为提取自芳香植物的次生代谢产物，被广泛应用于食品行业[1]。其中，薰衣草精油具有镇静安神、抗氧化、抗菌、抗炎症和止痛等多种生物活性[2]。但是，精油具有疏水性质，限制了其在食品中的应用[3]，因此需要发展一种有效的载运体系，以提升薰衣草精油的使用性能。

微乳液是一种由一定配比的表面活性剂、助表面活性剂、水和油自发形成的各向同性、外观透明或半透明、热力学稳定的分散体系，具有提高油性物质亲水性和抗氧化性的作用[4]。对单相微乳液而言，根据油或者水作为分散相的情况，将微乳液划分为O/W型、W/O型和双连续型3 种[5]。近期研究显示，微乳体系对活性物质的保护作用与相行为有一定关联。Deng Lingli等[6]发现百里香酚微乳液从W/O到双连续再到O/W型的过程中，随着水相的增加，抗氧化性提升而抑菌性下降。同时，植物精油微乳液的清除自由基活性与体系中的表面活性剂、助表面活性剂浓度有关。Kim等[7]发现在茶树精油微乳液中，蔗糖月桂酸酯为表面活性剂和丙二醇为助表面活性剂的配方对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除起到负面作用。由此可见，微乳体系能够实现植物精油的增溶与增效，但需要进一步深入研究其微观结构转变与精油活性成分之间的关系。

本实验以Tween-80作为非离子型表面活性剂，二丙二醇（dipropylene glycol，DPG）为助表面活性剂，构建可以无限稀释的薰衣草微乳体系；通过对染料扩散实验和电导率及黏度的测定，分析其微观结构转变；通过对DPPH自由基和2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）阳离子自由基清除率的测定，研究微乳结构转变对抗氧化性能的影响，从而为植物精油微乳体系在食品中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

薰衣草精油（lavender essential oil，LO） 新疆生产建设兵团第十四师47团；Tween-80、DPG、氯化钠、苏丹III、DPPH和乙醇 国药集团化学试剂有限公司；ABTS试剂盒 碧云天生物技术研究所。

1.2 仪器与设备

PL 403电子天平、手动移液器（100 μL） 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SHZ-B水浴恒温振荡器 上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；DDB-303A电导率仪 上海电子科技仪器有限公司；DV-I布氏黏度计 美国博勒飞公司；JA-2003电子天平 上海天龙仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 微乳体系的构建

采用滴水法，将油相（m（薰衣草精油）∶m（DPG）=1∶1）和表面活性剂（Tween-80）按照一定质量比（1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1）混合，水浴振荡至均匀后，间隔滴加蒸馏水，振荡，待其恢复澄清透明状态，浑浊时停止加水并记录加水总量。按照临界点油相、表面活性剂相和水相所占比例，借助Origin Pro 9.1软件绘制出对应的三元相图，通过三元相图能够较为直观地了解助表面活性剂对（微乳区）面积的影响[8]，从而确定微乳单相区，计算出微乳单相区占三元相图总面积的比例。

1.3.2 微乳体系微观结构测定

染色法：选取油溶性染料苏丹III（1.0 g/L），分别等量滴加于水分质量分数不同的微乳液试管中，轻微摇晃，观察颜色的扩散现象[9]。

电导率法：在体系中添加少量的NaCl（0.01 mol/L）作为电解质[10]，于25 ℃条件下进行电导率的测定。电解质在体系中跟随水相流动，因此能够间接反映水相的行为变化。

黏度的测定：测试采用LV-01（61）转子，所有样品均以固定的转速5 r/min进行测试，测试结果单位用cP表示[11]。

1.3.3 微乳体系抗氧化能力测定

DPPH自由基清除率法：参考Deng Lingli[6]和Kim[7]等的方法测定DPPH自由基清除率，将2.0 mL微乳液与100 μL 2.0 mmol/L的DPPH乙醇溶液振荡混合摇匀，25 ℃下静置90 min（避光保存）。以等量（2.0 mL）乙醇代替微乳液作为空白。根据公式（1）计算DPPH自由基的清除率。

式中：Ab为空白溶液吸光度；As为测试样品溶液吸光度。

使用ABTS试剂盒测定ABTS阳离子自由基清除率。将微乳液样品（10 μL）与新鲜配制的ABTS溶液（200 μL），黑暗中孵化12～16 h后，将该混合物在25 ℃条件下振荡10 min，在734 nm波长处测定其吸光度。根据公式（2）计算ABTS阳离子自由基的清除率。

式中：Ab为空白溶液吸光度；As为测试样品溶液吸光度。

1.4 数据统计与分析

理化指标表征实验重复1 次，每次处理3 个平行。三元相图采用Origin Pro 9.1软件绘制。

2 结果与分析

2.1 DPG对薰衣草微乳体系的增溶作用

图1 薰衣草-DPG微乳体系在25 ℃时的三元相图Fig. 1 Ternary phase diagrams of systems at 25 ℃

短链醇常作为助表面活性剂用于微乳体系的构建[12]。本实验将DPG与薰衣草精油（1∶1，m/m）为油相构建三元相图，结果如图1所示。图1中的阴影区域代表浑浊区，白色区域代表单相区（即微乳液形成区域）。DPG作为助表面活性剂时，单相区面积（Am）由单一薰衣草精油微乳液时的34.1%增大到71.4%，对薰衣草精油微乳液具有明显的增溶效果。影响表面活性剂界面行为的3 个因素是界面张力、自发曲率和弯曲刚度。在微乳液中，多元醇能够降低油相和水相界面之间的界面张力[13-14]。在已报道的一些植物精油及其主要成分的非离子型微乳体系中，乙醇、1,2-丙二醇等常见短链醇作为助表面活性剂添加到油相中，油/醇质量比为1∶1时，单相区面积一般在40%～50%范围内[6,15]。本研究发现DPG对薰衣草精油具有增溶作用。推测DPG的碳链长度和羟基位置利于其嵌入界面改变基团的极性，从而使界面膜自发曲率的发生更利于微乳液的形成[16]。因此，选择薰衣草-DPG微乳体系无限稀释线D82中水分体积分数不同的体系，进行后续微观相行为转变和抗氧化性研究。

2.2 微乳体系类型鉴定及微观结构的转变

通过观察油溶性染料苏丹III在不同水分体积分数薰衣草-DPG微乳体系中的扩散状态，可以直观判断微乳液类型。当苏丹III在微乳液中扩散非常均匀时，说明微乳液为W/O型；反之，若苏丹III浮于微乳液表面，则说明其为O/W型；若状态介于两者之间，则为双连续型微乳液[17]。

在无限稀释线D82上分别取水分体积分数为0%～90%的微乳体系进行苏丹III扩散实验，可以发现油溶性染料能够完全扩散在水分体积分数为0%～30%的微乳体系中（图2），且完全不溶解于水分体积分数为60%～90%的微乳体系。说明当水分体积分数为0%～30%时该薰衣草-DPG微乳体系为W/O型微乳体系，水分体积分数在40%～50%之间为双连续型，水分体积分数超过60%时其微观结构转变为O/W型。

电导率测定结果与染色法结果一致。随着水分体积分数增加，微乳体系的电导率变化总体呈现出不断上升的趋势。当水分体积分数为0%～30%时，微乳液的电导率较小，这是由于水分子被反向胶束所束缚，分散于油相中，水分子之间不能相互作用，符合W/O型的特征[18]。当水分体积分数继续增加时，微乳体系结构从W/O型转变为双连续相，电导率的增幅最大。在该阶段，反向膨胀的胶束被缓慢地扭曲，水分子变得更具有流动性，在水分子液滴碰撞之间的流动水通道产生渗流状态，因此电导率增加最快[19]。当水分体积分数大于60%时，微乳体系结构转变为O/W，电导率持续升高，说明更多的或全部水分子脱离了反向胶束的束缚，分子间相互碰撞也更加剧烈[20]。另外观察到O/W阶段电导率的增加速率略低于双连续阶段，可能与水分子流动性的增加和纯水稀释效应有关[7,21]。

图2 不同水分体积分数的微乳体系电导率Fig. 2 Electrical conductivity of microemulsion systems with different water contents

2.3 微观结构转变对微乳体系黏度的影响

微乳液作为抗氧化复合载体应用到具体产品中时，黏度是重要的物理参数。微乳液的宏观黏度会受到微观结构的影响[22-23]。图3为薰衣草-DPG微乳体系黏度变化趋势，可以看出该体系是“钟型”曲线[10,24]。在水分体积分数0%～30%区间，黏度很低且变化小，这可能取决于W/O结构[24]。当水分体积分数从40%增加到50%，黏度上升速率显著加快。这一阶段双连续结构形成，界面面积逐渐增加，界面之间相互作用也更加频繁，水-油通道的聚集和相互连接在宏观上表现为微乳体系黏度的不断增加[25]。随着水分体积分数的继续增加，最大黏度出现在水分体积分数为50%左右，正是微乳体系由双连续相到O/W体系的转变点。Sharma等[26]的研究表明，六方相存在于水分体积分数为30%～47%的水溶液中。Bonacucina等[27]研究了Tween-80/肉豆蔻酸异丙酯（9∶1，m/m）的微乳体系，当体系水分体积分数为20%～60%时，发现有类似凝胶结构的形成。由此推测，薰衣草-DPG微乳体系中双连续相高黏度现象可能是六方相或棒状结构胶束的形成所导致的，此时形成的胶束体积和单个胶束表面积均较大，导致胶束之间相互作用面积及相互作用力更大。当进一步提高体系的水分体积分数使其转变为O/W型时，常规球状胶束形成，破坏了棒状或者六方相结构的胶束结构，降低了胶束之间的相互作用以及它们之间相互碰撞的概率，从而出现黏度急剧下降的现象[6]。

图3 不同水分体积分数的微乳体系黏度变化Fig. 3 Viscosity change of microemulsion systems with different water contents

2.4 微乳体系微观结构对自由基清除能力的影响

2.4.1 DPPH自由基清除活性

图4 不同水分体积分数的微乳体系DPPH自由基清除率Fig. 4 DPPH radical scavenging activity of microemulsion systems with different water contents

DPPH自由基清除能力常作为检测物质抗氧化活性的指标。由图4可知，当微乳体系为W/O型和双连续相时，随着水分体积分数的增加，D82微乳体系DPPH自由基清除率快速提高。当水分体积分数提高到50%时，DPPH自由基清除率达到70%左右。但是，随着水分体积分数继续增加，体系结构由双连续结构转变为O/W结构，DPPH自由基清除率基本保持不变。

在薰衣草-DPG微乳体系D82的W/O阶段，水相被油相所束缚，包埋在反向胶束内，存在于体系中的多余表面活性剂胶束在反向胶束界面形成保护层，阻碍油相薰衣草油滴与DPPH自由基间的相互接触和作用；因此随着体系水分体积分数的升高，反胶束流动性提高，表现为DPPH自由基清除率快速提高。但是到了O/W阶段，相同的反应体积内薰衣草精油含量进一步降低，而DPPH自由基清除能力维持不变，这可能是随着结构的转变，逐步增加的自由水加速了自由基反应所致[28]。

2.4.2 ABTS阳离子自由基清除活性

ABTS阳离子自由基清除实验是可以同时评价脂溶性和水溶性物质抗氧化活性的方法[29]。图5反映了D82体系在734 nm波长处ABTS阳离子自由基脱色程度，即微乳液样品的总抗氧化能力[30]。从图5可以看出，当水分体积分数为0%～50%时，ABTS阳离子自由基清除率总体呈下降趋势。说明当微乳液在W/O型和双连续型的阶段，其ABTS阳离子自由基清除作用取决于精油的剂量[31]。在O/W型阶段，ABTS自由基的清除率随着水分体积分数的增加发生明显变化，在水分体积分数为70%时出现峰值，清除率达63%，与水分体积分数为0%的体系清除率基本相同。薰衣草精油的主要成分是芳樟醇、乙酸芳樟酯、1,8-桉叶油素、罗勒烯、萜烯醇和樟脑[32]。因而推测在体系转变为O/W型微乳后，释放出的亲水基团迅速与ABTS阳离子自由基进行反应。当微乳体系水分体积分数继续增加到80%～90%时，ABTS阳离子自由基清除能力迅速下降，这可能是同体积样品中薰衣草精油含量降低造成的。综合以上结果表明，微乳液微观结构和精油剂量对ABTS阳离子自由基清除活性有明显的影响。

图5 不同水分体积分数的微乳体系ABTS阳离子自由基清除率Fig. 5 ABTS radical scavenging activity of microemulsion systems with different water contents

3 结 论

本实验利用三元相图，以薰衣草精油和DPG等质量混合为油相，以Tween-80为表面活性剂，构建了一个可以有效提高薰衣草亲水性的多元微乳体系。以该体系微乳区域的一条无限稀释线D82为研究对象，通过染料扩散实验和电导率测定了其微观结构转变及其对微乳体系黏度变化的影响规律。通过抗氧化性实验发现，在O/W型阶段，虽然薰衣草精油含量低，但反应界面面积大，呈现出良好的DPPH自由基清除能力。ABTS阳离子自由基清除能力则在W/O型和双连续型阶段先下降，在进入O/W型阶段回升，并在水分体积分数70%时出现峰值，其受到精油含量与微观结构转变的双重影响。本研究结果可能为油性功能性原料多元体系在食品中的应用领域提供一定的理论支持。