肉桂醛协同超高压处理对牙鲆鱼片冷藏期间品质变化的影响

徐永霞，尹一鸣，赵洪雷，李学鹏，朱文慧，李秋莹，谢 晶，励建荣,*

（1.渤海大学食品科学与工程学院，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁 锦州 121013；2.上海海洋大学食品学院，上海 201306）

牙鲆（Paralichthys olivaceus）又称比目鱼、偏口等，广泛分布于中国、日本沿海和朝鲜半岛，是我国主要海水养殖鱼类中的名贵经济鱼类[1]。其肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富，深受广大消费者的喜爱。目前牙鲆鱼主要是鲜活销售，但由于鱼肉富含高蛋白质和水分，且不饱和脂肪酸含量较高，极易受内源酶、微生物及脂肪氧化作用而发生腐败变质[2-3]。据统计，我国水产品在贮藏、加工及流通过程中损失率高达15%，相当于发达国家平均损失率的3 倍，造成了我国水产资源的严重浪费[4]。

植物精油是一类新型生物保鲜剂，凭借其较强的抗菌和抗氧化活性，在水产品保鲜方面的应用越来越广泛[3,5]。其中肉桂醛是一种醛类化合物，为黄色的黏稠状液体，大量存在于肉桂、藿香以及桂皮等天然植物精油中，具有良好的抗氧化性和抑菌性，能够有效抑制水产品中腐败微生物的生长繁殖，延缓鱼肉挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值的升高，对水产品的保鲜效果显著[6-7]。Dong Zheng等将肉桂油应用于南美白对虾的包装中，利用其抗菌作用达到了良好的保鲜效果[8]。但是有些精油存在强烈的气味，会影响水产品的感官接受性，所以在实际应用中要控制使用浓度或采用包埋技术进行掩蔽[3]。Lyu Fei等研究了γ射线辐射结合肉桂油对鱼片品质的影响，发现两者联合使用具有协同增效的作用，因此在有效保持鱼肉品质的同时可以降低辐射剂量和肉桂油浓度[7]。董志俭等通过微胶囊技术包埋姜黄油，发现将其运用到鱼丸保鲜中，能有效减缓脂肪氧化，延长鱼丸的保质期[9]。

超高压是一种新型的冷杀菌技术，只作用于非共价键结构，不会破坏蛋白质的一级结构，通过改变大分子物质的高级结构实现瞬时、高效杀菌，能在一定程度上抑制脂肪水解，钝化酶活力，延长食品的货架期，并能很好地保持食品原有的色、香、味和营养成分[10]。近年来，超高压技术在水产品贮藏与加工领域得到广泛应用，主要集中在虾、蟹、贝及鱼类等的脱壳、货架期延长、品质改良及快速冷冻和解冻方面[11]。但是由于微生物对压力的敏感性不同，部分细菌对压力有很强的耐受性，限制了超高压技术在食品中的应用。因此，借助于栅栏效应，将抑菌剂与超高压技术结合使用，可增强超高压的杀菌效果，在较温和的压力条件下达到有效灭菌率[12]。有研究报道，超高压与Nisin、6-姜酚等协同处理对微生物的抑制作用明显加强，能破坏微生物的细胞膜，使保鲜剂易于渗入[13-14]。目前，国内外关于肉桂油或超高压单独处理对鱼肉品质的影响均有报道，但关于两者协同处理在鱼肉保鲜方面的应用报道较少。鉴于此，本实验以牙鲆为对象，研究了肉桂醛、超高压及肉桂醛和超高压协同处理对鱼片4 ℃贮藏过程中品质变化的影响，以期为牙鲆鱼低温贮藏保鲜技术提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活牙鲆购于锦州市林西街水产市场，每尾质量为（800±100）g。

肉桂醛 深圳市国鑫香精香料有限公司；羟丙基-β-环糊精 河南华瑞生物科技股份有限公司；平板计数琼脂培养基 北京奥博星生物技术有限责任公司；吐温-80天津永晟精细化工有限公司；TBA、三氯乙酸、高氯酸上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

HPP.L2-600/0.6超高压设备 天津市华泰森淼生物工程技术有限公司；UV-2550紫外-可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；TA-XT plus型质构分析仪英国Stable Micro Systems公司；FE20 pH计 梅特勒-托利多仪器有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台 苏景集团苏州安泰技术有限公司；LRH系列生化培养箱 上海一恒科技有限公司；JHG-Q60-P100均质机 上海融合机械设备有限公司；Kjeltec 8400全自动凯氏定氮仪 丹麦FOSS公司；1200高效液相色谱仪 美国Agilent公司；Biofuge stratos台式冷冻高速离心机 美国Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 保鲜剂的制备

根据预实验结果配制肉桂醛保鲜剂，保鲜剂包含0.2 g/100 mL肉桂醛、0.4 g/100 mL羟丙基-β-环糊精和2 g/100 mL吐温-80。具体配制方法：称取4 g羟丙基-β-环糊精，超声溶解至澄清透明溶液，然后将2 g肉桂醛（经20 g吐温-80溶解）加入其中，定容到1 000 mL后在50 ℃下超声30 min，超声功率200 W。

1.3.2 样品处理

将新鲜的牙鲆鱼运至实验室，敲击头部致死，从鱼脊背处均匀剖成两片，去除鱼皮，清洗沥干后备用。将鱼片随机分成4 组，肉桂醛组鱼片放入肉桂醛保鲜剂中浸泡30 min后沥干，用无菌蒸煮袋密封；超高压组鱼片用无菌蒸煮袋密封，在200 MPa下保压处理10 min；肉桂醛+超高压组鱼片放入肉桂醛保鲜剂中浸泡30 min，沥干后用无菌蒸煮袋密封，在200 MPa下处理10 min；未处理样品直接用无菌蒸煮袋密封为空白组。所有样品均置于4 ℃冰箱贮藏，分别在第0、4、8、12、16、20天取样，进行各项指标的测定。

1.3.3 菌落总数的测定

根据GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数测定》，采用稀释平板计数法测定菌落总数。

1.3.4 持水性的测定

参考赵宏强等[15]的方法并适当修改，将鱼肉切成小块后准确称质量，记为m1/g；然后用滤纸包裹，放入离心管中，5 000 r/min离心9 min，沥干表面水分后再次称质量，记为m2/g。持水性按公式（1）进行计算。

1.3.5 TVB-N含量的测定

参照丹麦FOSS公司提供的方法[16]使用全自动定氮仪测定牙鲆鱼肉中TVB-N含量。

1.3.6 TBA值的测定

TBA值的测定参考马海建等[17]的方法并加以修改。称取10 g绞碎鱼肉于烧杯中，加入25 mL蒸馏水，均质后加入10 g/100 mL三氯乙酸25 mL，混匀后静置30 min，过滤，取5 mL上清液，加入5 mL 0.02 mol/L TBA溶液，将混合液在80 ℃恒温水浴锅中加热40 min，取出冷却至室温后在532 nm波长处测其吸光度。TBA值以每千克鱼肉中所含丙二醛质量表示，单位为mg/kg。

1.3.7 K值的测定

K值的测定参考Özogul等[18]的方法并稍作修改，称取5 g绞碎的鱼肉，加入25 mL 0.6 mol/L的高氯酸，均质后在1 940×g条件下离心10 min，取上清液，用1 mol/L的NaOH溶液调节pH值至6.5～6.8。然后在相同条件下再离心10 min，取上清液，用0.45 μm的无机滤膜过滤后备用。K值的计算见公式（2）。

式中：ATP、AMP、ADP、IMP、Hx、HxR分别表示三磷酸腺苷、腺苷酸、二磷酸腺苷、肌苷酸、次黄嘌呤、次黄嘌呤核苷的含量/（μmol/g）。

1.3.8 质构分析

将鱼肉切成边长为2 cm的正方体，使用质构分析仪TPA模式测定。设定参数为：测试前探头下降速率2.0 mm/s，测试速率1.0 mm/s，测试后探头回程速率1.0 mm/s，样品压缩形变量为50%，触发力值5 g，测定时间5 s，探头类型P/50。

1.4 数据统计与分析

所有数据至少为3 次平行实验的平均值。采用Origin 9.0软件作图，SPSS 19.0软件进行显著性检验，多重比较采用Duncan's检验，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同处理对牙鲆鱼片冷藏过程中菌落总数的影响

图1 不同处理组牙鲆鱼片冷藏过程中菌落总数的变化Fig. 1 Changes in total bacterial count in flounder fillets with different treatments during cold storage

菌落总数是用来判断食品的污染程度及卫生质量的有效指标，菌落总数能够直观地反映出食品的腐败程度[19]。国际食品微生物标准委员会（International Commission of Microbiological Specializations on Food，ICMSF）规定鱼肉中菌落总数超过6（lg（CFU/g））时即为腐败变质。由图1可以看出，不同处理组牙鲆鱼片的菌落总数均随着贮藏时间的延长而显著增加（P＜0.05），其中空白组的增长速度明显高于其他处理组（P＜0.05），贮藏12 d时空白组鱼片的菌落总数达到6.22（lg（CFU/g）），超过了ICMSF规定的可食用标准；肉桂醛和超高压单一处理组鱼片菌落总数在贮藏过程中差异不显著（P＞0.05），在16 d时分别达到6.18（lg（CFU/g））和6.22（lg（CFU/g）），而两者协同处理组鱼片中菌落总数增长速度最慢，在20 d时达到6.28（lg（CFU/g）），超过了可食用标准。因此空白组、肉桂醛处理组、超高压单一处理组、两者协同处理组的货架期分别为12、16、16、20 d。由此可见，超高压和肉桂醛协同处理具有一定的增效作用，可以增强对微生物生长繁殖的抑制能力，起到更好的保鲜效果，延长鱼肉的贮藏期。肉桂醛具有一定的疏水性，可以使菌体细胞膜通透性增强，同时其中的醛基能够与细菌中的蛋白质和酶作用，破坏细菌正常的生理代谢，从而达到抑菌效果[20]。微生物对压力敏感，超高压会损坏菌体细胞膜，致使内容物外漏，结构被破坏，同时膜蛋白、核糖体和细胞代谢等都会受到高压的作用，从而抑制微生物的生物活性[10,21]。Amanatidou等[22]研究发现，冷藏过程中鲑鱼肉中的嗜冷假单胞菌和腐败假单胞菌对高压处理最为敏感，在100 MPa下处理30 min即失活。Ojagh等[23]研究发现，鲑鱼在300 MPa下保压处理10 min后菌落总数减少5（lg（CFU/g））。超高压与肉桂醛的抑菌机制主要为灭活细菌孢子，而这种结合作用可以提高灭活速率，增强灭菌效果，推进亚致死损伤菌群的过度增生[12]。

2.2 不同处理对牙鲆鱼片冷藏过程中持水性的影响

持水性表示在一定外力作用下，食品束缚自身或外来水分的能力[24]。持水性越大，说明食品的保水性越好。如图2所示，新鲜牙鲆鱼肉的持水性为83.74%，随着贮藏时间的延长，各组鱼片的持水性总体呈显著下降趋势（P＜0.05）。其中，肉桂醛处理组鱼肉的持水性下降速度最慢，其次是肉桂醛和超高压协同处理组，而超高压处理组的持水性下降速度最快，且样品的持水性均低于空白组。由此可见，超高压处理会显著降低鱼肉的持水性。新鲜牙鲆的肌肉组织均匀，肌原纤维排列紧密，持水性强；贮藏过程中内源蛋白酶和微生物酶的作用导致蛋白质分解，鱼肉肌纤维结构遭到破坏，一部分水不能通过毛细管作用存在于肌原纤维的间隙中，从而使肌肉的持水能力下降；而经过超高压处理后，牙鲆肌肉中部分蛋白质发生变性，肌原纤维蛋白结构改变，从而改变蛋白质分子的持水能力。此外，超高压处理能使肌原纤维间的空隙变大，因此加大了持水性的下降程度[15]。这与Lakshmanan等[25]研究冷藏鲑鱼经超高压处理后的持水性变化结果相似。而两者协同组的持水性仍较好，可能是由于肉桂醛的存在，使得持水性下降速度较超高压处理组更慢，贮藏20 d时持水性仍达65.81%。

2.3 不同处理对牙鲆鱼片冷藏过程中TBA值的影响

鱼肉中不饱和脂肪酸氧化酸败是导致其腐败变质的主要原因之一，TBA值是评定鱼肉脂肪氧化程度的良好指标[26]。由图3可知，鱼肉样品的初始TBA值为0.5 mg/kg，随着贮藏时间的延长，各组的TBA值均显著增加（P＜0.05），其中空白组TBA值增加的幅度明显高于其他处理组（P＜0.05）。在贮藏16 d内，肉桂醛和超高压单一处理组之间差异不显著（P＞0.05）。据报道，当TBA值达到2 mg/kg时，表明鱼肉已开始腐败[27]。第12天时，空白组鱼肉样品的TBA值达到1.91 mg/kg，已接近腐败的程度，说明其脂肪氧化程度较严重。贮藏16 d时，经肉桂醛和超高压处理组鱼肉的TBA值分别为1.86、1.89 mg/kg，而两者协同处理组TBA值在第20天时才达到2.01 mg/kg。由此可见，单独使用肉桂醛或超高压处理均能延缓鱼肉脂肪氧化的速度，而两者协同处理对脂肪氧化的抑制效果更好。由于肉桂醛中含烯醛式结构，具有较强的还原性，能有效清除氧及自由基等，从而可抑制鱼肉的脂肪氧化[20]。有学者在对鲭鱼的研究中发现，超高压处理能够抑制鱼肉中游离脂肪酸的生成，降低脂肪氧化程度，抑制鱼肉贮藏期间TBA值的增长速率；但压力过高会导致肌红蛋白等色素蛋白变性，释放铁等金属离子，反而会促进脂肪氧化[28-29]。

图3 不同处理组牙鲆鱼片冷藏过程中TBA值的变化Fig. 3 Change in TBA value of flounder fillets with different treatments during cold storage

2.4 不同处理对牙鲆鱼片冷藏过程中TVB-N含量的影响

TVB-N含量是评价鱼类等水产品新鲜程度的重要指标，可反映鱼肉蛋白质等含氮物质在酶及细菌作用下分解产生的氨及低级胺类含量[30]。根据GB 2733—2015《食品安全国家标准鲜、冻动物性水产品》规定，牙鲆等海水鱼的可食用标准为TVB-N含量不超过30 mg/100 g。如图4所示，新鲜牙鲆鱼肉的初始TVB-N含量为8.9 mg/100 g，属一级鲜度标准，随着贮藏时间的延长，空白组的TVB-N含量显著增加（P＜0.05），而其他处理组鱼肉的TVB-N含量在贮藏4 d后才显著增加（P＜0.05）。其中，空白组样品的TVB-N含量在12 d时达到29.76 mg/100 g，已接近可食用标准的限值，超高压和肉桂醛单一处理组的TVB-N含量在第16天时分别为32.31、31.93 mg/100 g，而两者协同处理组的TVB-N含量在第20天时超过规定的可食用限量值。这与菌落总数的变化结果一致。由此说明，肉桂醛和超高压处理均能延缓鱼肉样品TVB-N含量的升高，因为肉桂醛处理能有效抑制细菌的生长，从而降低蛋白质的分解速度，减缓TVB-N含量的上升；超高压处理能在一定程度上杀灭部分微生物并使酶失去活性，从而阻止了含氮物质的产生，抑制TVB-N含量的上升[15]；而超高压与肉桂醛协同处理对延缓TVB-N含量的增加具有一定的增效作用。

图4 不同处理组牙鲆鱼片冷藏过程中TVB-N含量的变化Fig. 4 Change in TVB-N content of flounder fillets with different treatments during cold storage

2.5 不同处理对牙鲆鱼片冷藏过程中K值的影响

K值是通过分析ATP及其关联化合物含量之间的关系而得到的数值，是评价鱼肉初期鲜度的指标。K值越大，鱼的新鲜度越差。一般将K值小于20%时划分为一级鲜度，可用于生食；20%～40%为二级鲜度，超过60%表明已开始腐败。由图5可知，新鲜牙鲆的K值为10.81%，属于一级鲜度标准，随着冷藏时间的延长，各组样品的K值不断增大（P＜0.05）。其中空白组的K值增长速率显著高于其他处理组（P＜0.05），在贮藏12 d时K值高达65.16%，表明鱼肉已开始腐败；肉桂醛和超高压处理组在贮藏16 d时的K值分别达到67.23%和69.02%，而两者协同处理组的K值上升速度最慢，在20 d时达到71%，鱼肉也已经腐败。因此，肉桂醛和超高压处理均能抑制ATP的降解，因为肉桂醛能够抑制内源5'-核苷酸酶的活性，进而降低肌苷酸的分解，保持鱼肉的新鲜度[3]；而超高压处理会导致蛋白质的变性，使酶失活，从而抑制ATP的分解[10]。此外，肉桂醛和超高压单独处理组的K值在贮藏过程中差异不显著（P＞0.05），这与菌落总数、TBA值等指标的变化规律基本一致，而两者协同处理具有增效作用，能更好地抑制ATP的分解。

图5 不同处理组牙鲆鱼片冷藏过程中K值的变化Fig. 5 Change in K value of flounder fillets with different treatments during cold storage

2.6 不同处理对牙鲆鱼片冷藏过程中质构特性的影响

鱼肉的质构特性主要与肌肉中蛋白质、脂肪及水分含量有关[31]。鱼类死后由于内源酶和微生物的作用，肌肉蛋白质降解、脂肪氧化、水分丧失，最终导致鱼肉质地变软、失去弹性[32]。鱼死后肌肉中ATP含量急剧下降，导致肌肉收缩变得僵硬，当ATP完全消耗后含量，肌肉僵硬结束，鱼肉又开始变软。不同处理组牙鲆鱼片贮藏过程中质构特性（硬度、弹性、咀嚼度和回复性）的变化如表1所示。随着贮藏时间的延长，各组鱼肉样品的弹性、咀嚼度和回复性均显著下降（P＜0.05），同时空白组的硬度也显著降低（P＜0.05），而处理组的硬度呈先增加后下降的趋势。在20 d的贮藏期内，处理组样品的变软速度低于空白组，贮藏末期时空白组的硬度较最初下降了74.0%，而经200 MPa超高压、肉桂醛及两者协同处理的鱼肉样品硬度下降幅度明显变小，其硬度分别下降了66.5%、54.3%和52.6%，明显低于空白组；此外，弹性、咀嚼度和回复性随贮藏时间延长均不断下降，各组与空白组之间的比较与硬度相似。由于肉桂醛和超高压处理均能在一定程度上抑制微生物的生长和酶的活性，延缓蛋白质的分解，降低脂肪氧化速度，从而改善鱼肉的质构特性。因此，超高压和肉桂醛处理均能有效减缓牙鲆鱼肉冷藏过程中质构的劣变，且两者协同处理效果更佳。

表1 不同处理组牙鲆鱼片冷藏过程中质构特性的变化Table 1 Change in texture properties of flounder fillets with different treatments during cold storage

3 结 论

实验结果表明，肉桂醛、超高压以及肉桂醛-超高压协同处理对牙鲆鱼片的保鲜效果均优于空白组，其中肉桂醛-超高压协同处理的鱼片持水性下降缓慢，细菌菌落总数、TVB-N含量、TBA值、K值均显著低于肉桂醛和超高压单独处理组（P＜0.05），且肉桂醛-超高压协同处理能有效减缓牙鲆鱼片冷藏期间硬度、弹性、咀嚼度等质构特性的下降。综合各指标可以得出，肉桂醛和超高压复合处理具有协同保鲜效果，能有效抑制牙鲆鱼片冷藏过程中微生物的生长，降低蛋白质降解和脂肪氧化程度，使其货架期比空白组延长约8 d，比肉桂醛和超高压单独处理组延长4 d左右。