γ-氨基丁酸对鸡蛋贮藏性能的影响

姜国川，闫晓慧，谭传欣，孙洪蕊，张佳霖，刘学军,*，王丽岩,*

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130118；2.吉林工商学院财税学院，吉林 长春 130507；3.吉林省农业科学院农产品加工研究所，吉林 长春 130033；4.吉林省轻工业设计研究院，吉林 长春 130021）

鸡蛋营养价值较高，其蛋白质和氨基酸比例适合人体生理需要[1]，由于其具有高水分、高营养成分，因此在贮藏过程中易品质不断劣化，并导致腐败[2-4]。延缓鸡蛋在贮藏期间的劣化速度以及提高鸡蛋品质成为研究热点。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一种活性较高的天然氨基酸，主要通过谷氨酸脱羧酶催化谷氨酸脱羧而产生，具有镇静安神、免疫调节、降血压、抗疲劳、改善脑机能等多种生理功能，能参与体内多种代谢活动[5-6]。2009年我国卫生部将GABA确立为新资源食品，GABA在发酵食品中含量较高，Takeshima等[7]对GABA做了毒性研究评估，结果表明GABA非常安全，可以作为一种功能性食品。Yang Jiali等[8]在因感染链格孢而腐烂的西红柿中注入不同质量浓度的GABA，发现当GABA质量浓度为100 μg/mL时，其对链格孢抑制效果最显著，原因可能是适宜质量浓度的GABA可以激活抗氧化酶，进而导致链格孢细胞死亡；同时GABA转氨酶和琥珀酸半醛脱氢酶的关键基因在GABA处理后被上调，GABA代谢旁路的激活可能在GABA诱导植物免疫的抗性机制中起重要作用。Fait等[9-10]发现较高水平的GABA可以抑制细菌中hrp基因的表达。此外，GABA在环境中的应激反应与GABA的代谢旁路有关，GABA的代谢旁路在pH值调节、氧化还原调节、能量产生和维持碳/氮平衡、连接氨基酸代谢和三羧酸循环中起作用。Yu Chen[11]、Yu Ting[12]等研究发现，外源GABA可以通过启动梨果实的防御反应来诱导其对青霉菌的抗性。

目前，国内外对GABA的研究多集中于其对食品保健功能特性的影响，有关外源GABA对贮藏期间鸡蛋品质影响的研究鲜见报道。综合以上研究结果，GABA可以参与蛋白质的代谢并具有一定的抑菌性，可以延缓食品的腐败进程。鸡蛋的腐败变质主要由蛋白质的变化以及溶菌酶构型的改变引起。基于此，本研究拟向鸡蛋中注入GABA，以蛋黄指数、哈夫单位（Haugh units，HU）为评价指标，研究GABA质量浓度、贮藏温度对鸡蛋贮藏性能的影响，并对鸡蛋贮存期间卵转铁蛋白、卵白蛋白的含量变化进行分析；从而揭示GABA对鸡蛋贮藏性能的影响，旨在为后续研究改善鸡蛋贮藏性以及提高鸡蛋品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

GABA粉末 自制；GABA标准品、磷酸吡哆醛上海阿拉丁科技股份有限公司；732型强酸型阳离子交换树脂（Na型）、卵白蛋白（优级纯）、DEAE-Sepharose-Fast-Flow 北京梦怡美生物科技有限公司；低分子质量蛋白Maker、5×蛋白电泳上样缓冲液、福林-酚试剂、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）试剂盒 北京鼎国昌盛生物有限公司；薄层层析板青岛海洋公司。

1.2 仪器与设备

JY04S-3C凝胶成像仪 北京君意东方电泳设备有限公司；HD-A电脑采集器、CBS-B程控多功能全自动部分收集器、HD-7电脑高灵敏紫外检测器 上海青浦沪西仪器厂；1260-6460液相色谱仪 美国安捷伦公司；层析缸上海信谊仪器厂；酶标仪 美国Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 GABA的制备及纯化

采取两段式发酵，先在pH 6.2、37 ℃适宜希腊魏斯氏菌Y24条件下培养16 h，将发酵液离心保留菌体，然后在pH 4.4、45 ℃条件下培养36 h，以积累更多的GABA。参考Tamura等[13]的方法，用离子交换色谱法对希腊魏斯氏菌Y24合成的GABA进行纯化，然后收集含有GABA的洗脱液，于60 ℃条件下旋转蒸发，至浓缩液体积几乎不变时停止，趁热加入100 mL无水乙醇，倒入烧杯中，立即再加入100 mL无水乙醇，不断摇晃旋蒸瓶以减少损耗，倒入同一烧杯，室温静置醇沉24 h，然后抽滤，在干燥瓶内于60 ℃烘箱中烘至恒质量。

1.3.2 薄层层析法验证GABA

参考王超凯等[14]的方法，验证实验制备的样品是否为GABA。将薄层板在105 ℃烘箱中活化2 h，以5 g/L GABA标准品作对照，在展开相中展开，当移动至薄层板上端1 cm时取出薄层板，用茚三酮溶液进行喷雾，在80 ℃烘箱中显色15 min，将出现的红色斑点与对照组做对比。

1.3.3 GABA纯度检测

应用Berthelot比色法测定GABA纯度[15]。

1.3.4 实验分组

将鸡蛋用10 mg/g新洁尔灭擦洗干净后晾干，对接种部位进行一次消毒（体积分数2%碘酒）和二次消毒（体积分数75%酒精），用1 mL注射器将100 μL GABA或生理盐水注射到鸡蛋内，利用氧化锌将针眼封住，然后用固体石蜡加固，在不同温度条件下贮藏14 d。按注射的物质将实验分为2 个对照组和4 个实验组：对照1（未添加任何物质）、对照2（添加生理盐水）和10、100、1 000、10 000 μg/mL GABA组，探讨不同质量浓度GABA处理对鸡蛋在37 ℃条件下贮藏14 d后新鲜度（HU值和蛋黄指数）的影响，得到最优GABA处理的质量浓度。再在最优质量浓度下，探讨贮藏温度（4、25、37 ℃）对GABA处理组和对照组（添加生理盐水）鸡蛋新鲜度的影响。

1.3.5 HU值、蛋黄指数的测定

分别参考董晓光[16]、赵美美[17]等的方法测定HU值和蛋黄指数。首先称量鸡蛋质量（m/g），再将鸡蛋横向破壳，将内容物置于水平玻璃板上，测量蛋黄边缘与浓蛋白边缘的中点高度，即为浓蛋白高度（h/mm），同时测量蛋黄高度及宽度，分别根据公式（1）、（2）计算样品的HU值和蛋黄指数。

1.3.6 蛋清蛋白的分离纯化

按照1.3.4节的实验方法对鸡蛋进行预处理，研究GABA对贮藏后（贮藏温度37 ℃、贮藏时间14 d）鸡蛋卵转铁蛋白、卵白蛋白质量浓度的影响。实验分为100 μg/mL GABA处理组和对照组（添加生理盐水）。参照麻小娟[18]的方法对蛋清蛋白进行分离纯化。纯化后蛋白质的确定：吸取各峰液体160 μL，加入40 μL 5×蛋白上样缓冲液（含β-巯基乙醇），沸水浴8 min，于－20 ℃保存备用。用SDS-PAGE法检测纯化后的蛋白质种类。

1.3.7 蛋白质量浓度的测定

参照麻小娟[18]的方法，应用福林-酚法测定蛋白质量浓度。

1.4 数据统计与分析

实验数据利用Excel软件进行处理，利用Origin 8.5.1、Lane 1D软件作图，利用Statistic软件进行HSD显著性分析。

2 结果与分析

2.1 纯化后GABA的验证结果

将纯化后的GABA利用薄层层析法验证，如图1所示，纯化后的GABA与GABA标准品纯度相近。将经过732型强酸型阳离子交换树脂层析柱纯化结晶后的GABA经再次溶解后，测得纯度为97.51%。

图1 纯化后的GABA与标准品的薄层层析结果对比Fig. 1 Comparison of thin-layer chromatogr results between purified GABA and standard

2.2 GABA对贮藏期间鸡蛋新鲜度的影响

2.2.1 不同GABA质量浓度处理对鸡蛋新鲜度的影响

图2 不同质量浓度GABA对鸡蛋新鲜度的影响Fig. 2 Effect of different concentrations of GABA on egg freshness

HU值是衡量鸡蛋新鲜度和鸡蛋品质的重要指标，亦是目前国际上衡量蛋品质的常用方法。定义当HU值在60～100时，为新鲜鸡蛋；在56～60时，为可食鸡蛋；小于40时，为变质鸡蛋[19]。由图2可知，对照组1、2的HU值接近60，新鲜程度低。其原因是，鲜鸡蛋中浓蛋白占总蛋白质量的50%～60%，随着贮藏时间的延长，浓蛋白会逐渐水样化，蛋白层之间的比例发生变化，浓蛋白逐渐变为稀蛋白，导致HU值降低[20-21]。随着GABA质量浓度的升高，鸡蛋的HU值呈先升高后降低的趋势，当GABA质量浓度为100 μg/mL时，鸡蛋HU值为71.51，显著高于其他组，此时的鸡蛋可以定义为新鲜鸡蛋，与Yang Jiali等[8]的实验结果一致。当GABA质量浓度为10 000 μg/mL时，鸡蛋的HU值为52.18，显著低于两个对照组，说明10 000 μg/mL GABA会加速鸡蛋的腐败变质。因此GABA的代谢可能影响到了蛋清中特定蛋白质的代谢，延缓鸡蛋腐败变质，低质量浓度的GABA对这一特定蛋白质的影响较少，而质量浓度过高会起到相反作用，加速鸡蛋的腐败变质。

蛋黄指数也是衡量鸡蛋品质的重要指标之一，蛋黄指数反映蛋黄的渗透压和含水量，鸡蛋内蛋黄膜的弱化和蛋清中的水分向蛋黄迁移导致蛋黄指数降低[22]。蛋黄指数大于0.3，定义为新鲜鸡蛋；蛋黄指数大于0.2，定义为合格鸡蛋，即蛋黄指数越大，鸡蛋新鲜程度越高。如图2所示，添加GABA的实验组蛋黄指数值均高于2 个对照组，其中2 个对照组鸡蛋贮藏后的蛋黄指数值接近0.2，可接受程度较低。当GABA质量浓度为100 μg/mL时，鸡蛋的蛋黄指数最大，此时的鸡蛋可以定义为合格鸡蛋。综上所述，当GABA质量浓度为100 μg/mL时，鸡蛋的HU值与蛋黄指数最高，鸡蛋新鲜程度最优。因此，选择此质量浓度进行以下实验。

2.2.2 不同贮藏温度对鸡蛋新鲜度的影响

如图3A所示，贮藏时间相同时，不同组鸡蛋HU值均随着贮藏温度的升高而降低。100 μg/mL GABA处理组HU值均高于对照组，在贮藏温度为4、25、37 ℃时，对照组与实验组的HU值分别为：85.20、86.91；64.90、72.28；61.83、71.50。Smith等[23]的研究结果表明，卵白蛋白巯基参与了蛋清稀化的过程；张银等[24]的研究结果表明加热会使卵白蛋白分子内α-螺旋、β-转角向β-折叠转化，分子间β-折叠结构的交联使分子结构展开，暴露出疏水基团。实验组在不同温度贮藏条件下的HU值均高于对照组，原因可能是贮藏过程中，GABA促进了鸡蛋中卵白蛋白的转化，使实验组卵白蛋白浓度低于对照组。

图3 贮藏温度对鸡蛋HU值（A）和蛋黄指数（B）的影响Fig. 3 Effect of storage temperature on Hough unit (A) and yolk index (B) of eggs

如图3B所示，蛋黄指数变化趋势与HU值趋势相似，随着贮藏温度的升高，两组鸡蛋蛋黄指数均呈现降低的趋势；但相同贮藏温度条件下，实验组的蛋黄指数均高于对照组，说明100 μg/mL GABA对于改善鸡蛋新鲜程度有一定的作用。鸡蛋贮藏期间内，蛋清内的水分逐渐向蛋黄内迁移，蛋黄内的盐则向蛋清内渗透，导致蛋黄体积不断增大，蛋黄膜弹性变弱，当体积进一步增大会形成散蛋黄的现象。高温有利于促进水分的渗透，从而使蛋黄的渗透压降低，因此高温条件下鸡蛋的蛋黄指数下降速率较快[25]。实验中发现高温条件下，样品产生贴壳现象的比较多；推测高温对蛋黄破坏性较强烈，可能是高温促进系带变细甚至消失，导致蛋黄移位上浮，造成贴壳现象[20]。

2.3 GABA对鸡蛋贮藏期间卵转铁蛋白及卵白蛋白含量的影响

2.3.1 DEAE-Sepharose-Fast-Flow层析结果

采用DEAE-Sepharose-Fast-Flow阴离子交换层析法对蛋清蛋白进行分离纯化，分离时蛋白质因带电荷的不同与树脂结合程度不同，因此对蛋清蛋白进行氯化钠浓度线性梯度洗脱，洗脱曲线如图4所示。当洗脱液氯化钠浓度为0 mol/L时，蛋清蛋白洗脱曲线上出现a蛋白峰，当洗脱体积达到100 mL时基线回归到0，改变洗脱液的离子浓度，将结合的蛋白质逐步洗脱下来。当氯化钠浓度为0.04 mol/L时，出现b蛋白峰，当氯化钠浓度为0.06 mol/L时峰值最大，之后缓慢趋于平缓。

图4 蛋清蛋白DEAE-Sepharose-Fast-Flow层析洗脱曲线Fig. 4 Elution curve of egg white protein by DEAE-Sepharose-Fast-Flow chromatography

2.3.2 卵转铁蛋白及卵白蛋白的SDS-PAGE结果分析

图5 卵转铁蛋白和卵白蛋白分离纯化的SDS-PAGE图Fig. 5 SDS-PAGE of purified ovotransferrin and ovalbumin

图5为蛋白分离纯化的SDS-PAGE图。对洗脱曲线的两个峰利用Lane 1D软件分析得到a、b峰蛋白质分子质量分别为74、46 kDa，与卵转铁蛋白、卵白蛋白的分子质量一致，说明a、b两峰分别代表卵转铁蛋白和卵白蛋白，与佟平[26]的实验结果一致。

2.3.3 GABA对贮藏后鸡蛋卵转铁蛋白及卵白蛋白质量浓度的影响

图6 GABA对贮藏期间鸡蛋中卵转铁蛋白和卵白蛋白质量浓度的影响Fig. 6 Effect of GABA on the concentrations of otransferrin and ovalbumin in eggs during storage

如图6所示，在相同贮藏条件下，100 μg/mL GABA处理组卵转铁蛋白质量浓度高于对照组，是对照组的1.12 倍。其原因可能是GABA促进了卵白蛋白向卵转铁蛋白的转化，并且温度越高卵转铁蛋白结合铁后氢键作用越强，对热的抵抗性越强[27]。

卵白蛋白质量占蛋清蛋白质量的54%～63%，是鸡蛋中主要致敏原之一。在相同贮藏条件下，实验组的卵白蛋白质量浓度低于对照组，仅为对照组的39%。综上所述，GABA对鸡蛋贮藏期间卵白蛋白质量浓度以及卵转铁蛋白质量浓度的变化有明显影响。GABA的添加有助于贮藏期间卵白蛋白向卵转铁蛋白转化，使卵转铁蛋白质量浓度较对照组高，而卵白蛋白质量浓度较对照组低。卵转铁蛋白是一种糖蛋白，在铁的螯合及运输过程中起关键作用，同时具有抗炎活性[28]。Kobayashi等[29]研究表明，卵转铁蛋白可以减轻小鼠经葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎症状。Wang Xiong等[30]通过模拟肽切割使用肿瘤坏死因子诱导的Caco-2细胞炎症的体外模型来评估卵转铁蛋白及其二肽的抗炎作用，结果表明卵转铁蛋白衍生二肽通过抑制丝裂原活化蛋白激酶信号途径发挥其抗炎活性。因此，GABA的添加有利于提高鸡蛋贮藏期间的品质。

3 讨 论

贮藏期间鸡蛋蛋清蛋白浓度与鸡蛋品质的变化关系是揭示鸡蛋品质变化的本质因素。卵白蛋白与卵转铁蛋白是蛋清蛋白的重要组成部分。Alleoni等[31]的研究结果表明，经6 个月的贮藏，鸡蛋卵白蛋白相对含量显著升高。付丹丹等[32]对贮藏期间卵白蛋白相对质量浓度与鸡蛋新鲜度指标之间的相关性进行分析，研究结果表明，鸡蛋蛋黄指数、HU值与卵白蛋白质量浓度之间呈现极显著负相关。金永国[27]、郑彩燕[33]等研究表明，卵转铁蛋白是蛋清中的主要抗菌蛋白，能够抑制蛋中的微生物生长，对鸡蛋品质的保持起着积极的作用。本实验对鸡蛋贮藏期间卵白蛋白和卵转铁蛋白两个蛋白组分进行研究，以期明确GABA处理对贮藏期间这两个蛋清蛋白组分质量浓度以及鸡蛋品质的影响。鸡蛋在贮藏期间新鲜度降低，蛋清稀化，导致HU值与蛋黄指数下降。贮藏期间鸡蛋品质的恶化主要是由蛋白质、溶菌酶构型变化[34]以及微生物增殖引起的。100 μg/mL GABA实验组的鸡蛋HU值、蛋黄指数高于对照组（未添加任何物质以及生理盐水组），卵转铁蛋白质量浓度高于对照组（生理盐水组），卵白蛋白质量浓度低于对照组（生理盐水组），原因可能是GABA代谢旁路参与了三羧酸循环[35]，影响到蛋清中蛋白质的代谢，进而促进卵白蛋白向卵转铁蛋白的转化，抑制溶菌酶构型的改变以及细菌的表达[8-12]，进而延缓鸡蛋的腐败进程。

4 结 论

本实验研究了GABA对鸡蛋贮藏性能的影响，通过比较不同质量浓度GABA处理鸡蛋贮藏后新鲜度指标，筛选出最优GABA质量浓度。在此基础上，探讨贮藏温度对最优GABA处理组和对照组（添加生理盐水）鸡蛋新鲜度的影响以及GABA对鸡蛋在37 ℃条件下贮藏14 d后卵转铁蛋白、卵白蛋白质量浓度的影响。研究结果表明：GABA的添加可以提高鸡蛋贮藏后的HU值、蛋黄指数以及卵转铁蛋白质量浓度，降低卵白蛋白质量浓度。因此，GABA能够提高鸡蛋的新鲜度，延缓蛋白质在贮藏过程中的变化，可以应用到其他食物中来减缓变质现象，或应用到饲料中提高鸡蛋品质。