鸽新城疫HB株水佐剂灭活疫苗的制备及免疫特性

李珮瑶，高晶萍，田 勇，徐明举，王存连，利 凯，李 军，兰金苹，张瑞华，徐 彤,

(1.河北北方学院 预防兽医学重点实验室，河北 张家口 075000；2.河北北方学院 生命科学研究中心，河北 张家口 075000)

鸽新城疫是由鸽Ⅰ型副黏病毒(Pigeon paramyxovirus Ⅰ, PPMV-Ⅰ)引起的常流行于鸽群的高接触性传染病，临床主要表现为鸽群肠炎、下痢及扭头转圈等神经症状[1]。不同品种、不同年龄阶段的鸽子都易感，日龄越小对该病的易感性越高[2]。鸽新城疫在鸽群中的传播十分迅速，发病率和死亡率都十分高。我国于1985年12月和1986年1月由深圳及珠海拱北动物检疫局从进口鸽中检测到鸽Ⅰ型副黏病毒[3-4]。近年来，陕西、山西、甘肃、新疆、河南等地又陆续有该病的流行[5-6]，并且该病的流行情况随着赛鸽养殖业集约化和规模化的发展愈演愈烈。

近年来，由于广泛的群众基础使赛鸽运动得到了快速发展，而因集鸽这一特殊养殖模式导致赛鸽在前期抵抗力低、容易感染疾病发病死亡[7-8]。在导致赛鸽发病死亡的诸多因素中，鸽新城疫病毒感染是重要原因之一。由于缺乏针对鸽新城疫的疫苗，所以临床中赛鸽免疫接种主要采用鸡新城疫疫苗。尽管鸽新城疫病毒与鸡新城疫病毒是同一属病毒，但因两者基因型及病原特性存在差异[9]，故鸡新城疫疫苗不能有效保护和控制鸽新城疫的感染和流行。因此，针对鸽新城疫疫苗的研究与开发成为防治鸽新城疫的当务之急。

集鸽这一饲养模式要求在短时间内产生较高的抗体水平，以提供迅速有效的保护作用。由于油佐剂疫苗吸收速度慢，抗体产生时间较长，并且肌肉注射常常会影响赛鸽胸肌发育，甚至会造成炎症，影响飞翔能力，导致比赛成绩不佳。与之相比，水佐剂疫苗抗体产生速度快，在短时间内可产生高水平的抗体，更适合赛鸽使用。目前，关于鸽新城疫水佐剂疫苗的报道较少，鉴于此,采用分离的鸽新城疫病毒HB株制备水佐剂疫苗，并对其灭活条件、安全性、毒性、最佳免疫剂量和抗体产生时间、免疫持续期和保护效果等进行了检测，以期为生产实践中赛鸽新城疫的免疫防控提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 毒株与供试动物 鸽新城疫病毒河北毒株(HB株)由河北北方学院预防兽医学重点实验室分离鉴定，于-80 ℃保存；SPF种蛋购于山东省济南赛斯家禽科技有限公司；30～40日龄、未经任何免疫的雏鸽购于张家口市某肉鸽养殖户。

1.1.2 主要试剂 鸡新城疫标准诊断抗原和阳性血清购于北京中越科技有限公司；水佐剂GEL 02 PR购于赛彼科特殊化学品有限公司；鸡新城疫疫苗(LaSota株)购于吉林和元生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 种毒的增殖 将病毒原液(稀释前滴度为9.0 log2)用灭菌生理盐水按1∶10 000倍稀释，经尿囊腔接种于9～11日龄SPF鸡胚，0.1 mL/胚。96 h收获上述鸡胚尿囊液，根据常规血凝试验测HA滴度，将病毒滴度在8.0 log2及以上的含病毒尿囊液保存备用。

1.2.2 病毒灭活条件的筛选 将病毒离心，取上清混合后再次检测病毒滴度，然后分装，用不同含量(0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.30%)的甲醛和不同含量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%)的二乙烯亚胺(BEI)在4 ℃和37 ℃的条件下灭活病毒，BEI在灭活结束后用过量硫代硫酸钠终止灭活。在灭活8、16、24 h时取样，进行HA滴度检测及无菌检测及灭活效果检测，以确定病毒最佳灭活条件。

1.2.3 疫苗制备 将购买的水佐剂GEL 02 PR于30 ℃下无菌混匀，然后将水佐剂与灭活的病毒按照1∶9的比例混匀，并在混匀终止前加入0.01%的硫柳汞防腐，即制成水佐剂灭活疫苗，将其分装，密封好。

1.2.4 疫苗效力评价

1.2.4.1 物理性状 将制备的水佐剂疫苗在4 ℃和室温条件下放置90 d观察性状有无变化、分层情况。

1.2.4.2 安全性试验 将制备的水佐剂疫苗注射30～40日龄未经免疫的雏鸽，确定其安全性。将20只供试雏鸽随机分为4组，分别注射0.2、0.3、0.5、1.0 mL疫苗，每个剂量5只。观察疫苗吸收是否良好、有无炎性反应，是否有其他副作用，观察21 d。

1.2.4.3 毒性试验 将20只供试雏鸽分为2组，即水佐剂疫苗组和对照组，每组10只。水佐剂疫苗组颈部皮下注射0.3 mL水佐剂疫苗，对照组注射同等剂量生理盐水，每天称量雏鸽体质量，观察15 d，记录体质量并根据其变化绘制生长曲线。

1.2.4.4 疫苗的最佳免疫剂量和抗体产生时间 将30只新城疫抗体呈阴性的雏鸽分为3组，每组10只，分别注射不同剂量(0.2、0.3、0.5 mL)水佐剂疫苗进行免疫，在免疫后7、14、21、28、40 d翅静脉采集血液，收集血清，检测抗体水平，结果以log2表示，确定疫苗的最佳免疫剂量以及免疫后抗体产生的规律。

1.2.4.5 免疫持续期和保护试验 将60只未经免疫的雏鸽随机分为2组，水佐剂疫苗组、对照组各30只。水佐剂疫苗组按最佳免疫剂量颈部皮下注射水佐剂疫苗，对照组注射同等剂量生理盐水。在免疫后30、90、180 d从水佐剂疫苗组、对照组各抽取10只肌肉注射0.2 mL鸽新城疫病毒进行强毒攻击，观察21 d，并记录发病率、死亡率，根据以下公式计算保护指数(PI)：

1.2.4.6 对比试验 将30只新城疫抗体检测呈阴性的雏鸽随机分为3组，水佐剂疫苗组、LaSota组、对照组，每组10只，水佐剂疫苗组皮下注射水佐剂疫苗0.3 mL，LaSota组注射鸡新城疫疫苗(LaSota株)0.3 mL，对照组相同途径注射0.3 mL生理盐水。

以上3组在免疫后7、14、21、28 d时采血，检测抗体水平。在免疫28 d后进行强毒攻击，肌肉注射0.2 mL HB株新城疫病毒，观察记录3组发病情况。

1.2.4.7 保存期试验 将水佐剂灭活疫苗分别保存于4 ℃和室温(20 ℃左右)条件下，在保存0、30、60、90、120、150、180 d时，免疫供试雏鸽，皮下注射0.3 mL，免疫后观察有无不良反应，并于免疫后28 d采血检测抗体水平。

2 结果与分析

2.1 HB株新城疫病毒灭活条件的筛选

根据表1和表2可知，病毒灭活后的效价下降程度与灭活剂的用量、灭活温度、灭活时间有关。在甲醛含量为0.05%时，病毒灭活后效价降低幅度较小，但病毒几乎都未完全灭活并且菌检可检查出细菌；甲醛含量为0.10%，灭活时间为16 h，4 ℃和37 ℃条件下的病毒都被完全灭活，但在37 ℃条件下无细菌生长，4 ℃条件下仍有细菌；采用1.0%的BEI在灭活16 h时未达到灭活要求，灭活时间为24 h时，病毒可被完全灭活。随着2种灭活剂含量越来越高，灭活后的病毒效价受到的影响越来越大，故最终选用0.10%甲醛在37 ℃条件下灭活16 h为最佳灭活条件。

表1 不同含量甲醛灭活HB株新城疫病毒的效果Tab.1 Results of different levels of formaldehyde inactivated HB strain Newcastle disease virus

注：“B”表示细菌生长情况，“+”表示有细菌生长，“-”表示无细菌生长；“I”表示病毒灭活情况，“Y”表示彻底灭活，“N”表示未彻底灭活。下同。

Note:“B” indicates bacterial growth, “+” means bacterial growth,and “-” means no bacterial growth;“I” indicates virus inactivation, “Y” means complete inactivation, and “N” means not completely inactivated.The same below.

表2 不同含量BEI灭活HB株新城疫病毒的效果

2.2 水佐剂疫苗效力评价

2.2.1 物理性状 制备的水佐剂疫苗在4 ℃和室温条件下保存90 d均无分层现象；疫苗呈无色、透明状液体，均匀度好，黏度低。

2.2.2 安全性试验 注射不同剂量水佐剂灭活疫苗后并未对雏鸽产生不良影响，注射后雏鸽精神状态良好，注射部位无结块、肿胀现象。

2.2.3 毒性试验 从图1雏鸽的生长曲线可知，水佐剂疫苗组雏鸽的生长状况与对照组无明显差异，表明该灭活疫苗对雏鸽生长发育无影响，具有安全无毒性。

图1 雏鸽生长曲线Fig.1 Growth curve of young pigeons

2.2.4 最佳免疫剂量和抗体产生时间 根据表3可知，制备的水佐剂疫苗免疫后7 d可以检测到抗体产生，21 d抗体水平可达到8.7 log2，28 d时达到顶峰(9.2 log2)，40 d仍有稳定良好的抗体水平。0.2 mL注射剂量产生的抗体水平低于0.3 mL和0.5 mL组，0.3 mL组与0.5 mL组水平大致相同。综合考虑经济成本和免疫效果，最终将该疫苗的最佳免疫剂量定为0.3 mL。

表3 水佐剂疫苗的最佳免疫剂量和抗体产生时间(log2)Tab.3 Optimal immunization dose and antibody production time for water adjuvant vaccine(log2)

2.2.5 免疫持续期和保护试验 从表4可以看出，制备的水佐剂疫苗在免疫30 d后可以产生良好的抗体水平，抵挡强毒攻击，保护指数为100.0；在免疫90 d后，疫苗的保护指数仍在66.7。表明制备的水佐剂灭活疫苗的免疫持续期至少维持30 d，建议在首次免疫1个月后使用油佐剂疫苗进行二免，以维持抗体水平。

表4 水佐剂疫苗的免疫持续期和保护试验结果Tab.4 Results of immune duration and protection test for water adjuvant vaccine

2.2.6 对比试验 从表5中可知，制备的水佐剂疫苗产生的抗体水平高于鸡新城疫疫苗(LaSota株)，制备的水佐剂疫苗在强毒攻击时的保护率为100%，鸡新城疫疫苗(LaSota株)在抗体水平达到6.7 log2时的保护率仅为30%。对照组全部感染发病。

表5 水佐剂疫苗与鸡新城疫疫苗(LaSota株)的对比试验结果(log2)Tab.5 Comparison test results between water adjuvant vaccine and chicken Newcastle disease vaccine(LaSota strain)(log2)

2.2.7 保存期试验 由表6可知，水佐剂疫苗在4 ℃条件下保存180 d仍可产生良好的免疫水平；在室温(20 ℃)条件下保存90 d产生的免疫水平较为稳定，保存120 d时免疫后抗体水平开始降低。所以，建议疫苗在4 ℃条件下的保存期为180 d，在室温(20 ℃)条件下保存期为90 d，不超过120 d。

表6 水佐剂疫苗的保存期试验结果(log2)Tab.6 The water adjuvant vaccine shelf life test results(log2)

3 结论与讨论

由于目前没有筛选出鸽新城疫弱毒株，因此，用分离毒株制备灭活疫苗成为必然选择。然而病毒的灭活受到灭活剂种类、浓度、灭活温度、时间等影响。一般来说，随着灭活剂浓度和灭活温度增高，病毒所需灭活时间缩短；随着灭活时间的延长、灭活剂浓度和灭活温度增高，病毒灭活后的效价会降低。因此，在保证疫苗的安全性和免疫原性的情况下，应尽量选择低浓度、较低温度、短时间的灭活条件。本研究采用甲醛和BEI两种灭活剂以及不同的灭活剂量、温度、灭活时间对该病毒的最佳灭活条件进行了摸索，结果发现，BEI对鸽新城疫病毒的灭活效果较差，低含量的BEI无法彻底灭活病毒。KING等[10]研究发现，0.01 mol/L的BEI可将病毒彻底灭活且对其效价影响不大，这与本研究结果差异较大，原因有待考证。而使用甲醛灭活既能保证病毒的免疫原性又能保证安全，最终确定该病毒的最佳灭活条件为使用0.10%的甲醛在37 ℃条件下灭活16 h。徐守振等[11]发现，采用0.10%～0.20%的甲醛在37 ℃条件下灭活22～24 h可将新城疫病毒彻底灭活，这与本研究的最佳灭活条件相近。

本研究将灭活后的病毒制备成水佐剂疫苗，并对该疫苗进行了效力评价。物理性状检测合格后注射1日龄乳鸽，对其生长发育并无影响，并且免疫35日龄雏鸽后没有不良反应，表明制备的疫苗安全无毒副作用。然后对疫苗免疫后的抗体产生规律进行了研究，发现免疫后7 d已经有抗体产生，28 d达到顶峰，在短时间内即可产生较高水平的抗体。王晓丽等[12]采用鸽新城疫NJ株制备相关油佐剂灭活疫苗，免疫后抗体产生规律与本试验的水佐剂疫苗相似，但在短时间内本试验中的水佐剂灭活疫苗抗体水平更高，更适用于赛鸽使用。在免疫后30 d进行强毒攻击时，制备的水佐剂疫苗的保护指数为100.0，免疫后90 d保护指数为66.7，表明制备的水佐剂疫苗免疫后可在短时间提供有效的抗体保护，并且至少可维持1个月。

与鸡新城疫疫苗(LaSota株)进行对比发现，制备的水佐剂疫苗产生的抗体水平高，在强毒攻击时9.0 log2水平的鸽新城疫疫苗的保护率是100%，6.7 log2水平的鸡新城疫疫苗保护率只有30%，表明鸽新城疫灭活疫苗较鸡新城疫灭活疫苗更适宜用于鸽新城疫的防控，分析原因可能是鸡新城疫与鸽新城疫虽然相似，但两者在致病性和抗原性有差异[13-14]，导致相似的抗体水平无法提供相似的保护率。叶贺佳等[15]将鸽源新城疫病毒制备成灭活疫苗免疫后进行交叉攻毒试验，发现在受到鸽源新城疫强毒攻击时，鸽新城疫疫苗保护率比鸡新城疫疫苗高50%。张俊平等[16]也发现，鸡新城疫疫苗和鸽新城疫疫苗免疫鸽后产生的抗体水平无明显差异，但在后续的攻毒试验中，鸽新城疫疫苗的保护效果明显优于鸡新城疫疫苗。尽管本研究的鸽新城疫水佐剂疫苗在一定群体试验中具有较好的免疫效果，但是仍需后期进行大量的田间试验，以期能够为临床赛鸽新城疫的防控提供参考。