内皮祖细胞来源的外泌体减轻血管内皮细胞缺氧性损伤*

李罗成 王志维 吴红兵 任宗力 任 伟

血管内皮功能失调和损伤是心脑血管疾病发生的关键环节。引起血管内皮细胞功能失调和损伤的因素很多，缺氧是常见的因素之一。根据文献报道，患有睡眠呼吸暂停综合征或慢性阻塞性肺部疾病的患者，心脑血管疾病的发病率是正常人群的3-4倍[1]。内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs)在血管内皮细胞损伤和修复过程中主要通过两种方式发挥重要作用：一是直接分化为成熟内皮细胞进行修复，二是通过旁分泌多种生物因子促进内皮细胞增殖、迁移及损伤状态下的存活[2]。

在细胞进行旁分泌过程中，外泌体(Exosomes，EXOs)起着类似货仓的作用。EXOs是由真核细胞分泌的一种小囊泡，大部分直径约30-100nm。因其在体液中可稳定存在，并包含多种生物调节因子，可产生与其来源细胞相同的作用，近年来作为一种理想的基因载体引起广泛关注[3-4]。EXOs通过细胞间质或循环系统将细胞产生的生长因子、mRNA和miRNA转运至靶细胞，被靶细胞摄取后调控靶细胞的生物学行为[5]。来源于EPCs的外泌体(EPCs-EXOs)是否也能执行转运功能，从而实现EPCs的部分甚至全部生物学功能，值得探讨。本文利用EPCs-EXOs干预经缺氧处理的人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs)，以明确EPCs-EXOs对内皮细胞缺氧损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂

EPCs和HUVECs(Lonza公司，瑞士)，鼠抗CD63多克隆[TS63]抗体、兔抗α-tubulin多克隆抗体、HRP标记羊抗兔IgG、HRP标记兔抗鼠IgG(Abcam，英国)。兔抗CD81多克隆抗体(Santa Cruz，美国)，EXOs提取液(Total Exosome Isolation Reagent)(Invitrogen，美国)。RIPA lysis buffer、BCA蛋白检测试剂盒、CCK-8试剂盒(碧云天生物技术有限公司，中国)。

1.2 方法

1.2.1EPCs培养及传代：冻存的EPCs细胞株复苏后，放入预涂过I型鼠尾胶的6孔培养板，采用含有5%胎牛血清和细胞因子的EGM-2 MV培养基，于37℃、5% CO2的培养箱中培养。每2天更换一次培养液直至传代。于倒置相差显微镜下观察，当细胞生长达到培养板底部的80%-90%时进行传代，第2-6代细胞用于实验。

1.2.2外泌体提取：传代后的EPCs用无外泌体血清的培养基培养48h，收集培养液，2 000g 离心30 min去除细胞和细胞碎片。将离心后的培养基以比例2∶1(v/v)添加EXOs提取液，4℃孵育过夜后10 000g离心1h。离心沉淀物即为外泌体，-80℃保存。

1.2.3Western blot检测EXOs膜性标志物：在提取的EXOs中加入适量RIPA lysis buffer，BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。根据蛋白定量结果，取50μg蛋白质经15%聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干法转移到PVDF膜。转膜后置于含5%脱脂奶粉的TBST中进行封闭，加入一抗室温孵育2h，TBST洗涤后再加入HRP标记的二抗，37℃孵育1h。ECL化学发光，胶片曝光，采用Image J软件对Western blot结果进行条带灰度分析。以a-tubulin蛋白为内参照，目标蛋白与a-tubulin蛋白条带灰度比值为该蛋白的相对表达量。

1.2.4EXOs电镜样本制备和观察：取出-80℃冰箱中保存的EXOs，放于冰水混合物中解冻，用4℃ 1×PBS将EXOs稀释为0.5mg/ml的悬液。将碳包覆镍网置于滤纸上，吸取20μl EXOs悬液，滴至碳包覆镍网上，红外灯下烘烤5min，烘干后在碳包覆镍网上滴加1-2滴1%磷钨酸，再次烘烤5min，于透射电镜下观察EXOs形态。

1.2.5HUVECs分组处理：HUVECs复苏后，采用含10%胎牛血清和1%双抗(青链霉素混合液)的RPMI 1640 培养液，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养，2-3天更换培养液。通过倒置相差显微镜观察细胞，当细胞生长面积达到培养板底部的80%或出现接触抑制时，进行传代。传代次数为3-7次的HUVECs用于实验。缺氧处理时，当细胞生长面积达到培养板底部的80%，将培养板放置于低氧培养箱(1% O2，5% CO2，94% N2)中培养8h。低氧处理后，再将细胞移到常规培养条件下培养，并在不同时间点检测细胞增殖、凋亡和迁移情况。实验分为三组：(1)正常对照组，按上述方法培养，但不作缺氧处理；(2)缺氧组，采用上述方法培养的HUVECs；(3)缺氧+EPCs-EXOs组，进行缺氧处理前，在HUVECs中加入EPCs-EXOs，随后即开始缺氧处理。

1.2.6CCK-8试剂盒检测HUVECs增殖：将各组HUVECs按每孔4×103个接种至96孔板中，按照实验分组处理后置于细胞培养箱中培养(37℃，5% CO2)，培养0h、24h、48h后弃培养基，每孔加入新鲜配制的10μl毒性检测液CCK-8，将培养板在培养箱孵育4h后，用酶标仪测450nm波长处的吸光度(OD值)，根据公式计算相对细胞增殖率：细胞增殖率=实验组OD值/正常对照组OD值×100%。

1.2.7流式细胞仪检测HUVECs凋亡：将培养0h、24h、48h的HUVECs通过流式细胞术进行凋亡检测。收集培养液中悬浮的细胞和培养瓶内贴壁的细胞，离心后弃去上清，滴加200μl Annexin V-FITC结合液，震荡重悬细胞后再加入5μl Annexin V-FITC并混匀，在4℃下避光孵育15min。再在上述重悬细胞中加入5μl PI 染色液，混匀后于4℃下避光孵育5min，随后通过流式细胞仪检测分析凋亡细胞比例。

1.2.8划痕法检测HUVECs迁移：先将6孔板背后用直尺和标记笔均匀划上间隔为0.5cm的横线，每孔至少穿过5条线；然后每孔加入约5×105个HUVECs，并加入培养基进行培养；第二天用移液器枪头对6孔板底部的细胞进行划痕，再用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，根据实验分组对细胞进行处理，然后放入37℃、5%CO2培养箱培养，分别于0h、24h、48h拍照，比较各组细胞在各时间点迁移率：细胞迁移率=1-实测划痕面积/初始划痕面积，因拍照所取的划痕长度一致，实际计算细胞迁移率=1-实测划痕宽度/初始划痕宽度。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 EPCs-EXOs的结构

经透射电镜观察EXOs的外观结构，可见EXOs呈椭圆形或杯状膜性囊泡，大小不等，直径约40-110nm，较多EXOs聚集在一起呈葡萄状排列。囊泡因内容物不同呈现出不同的透亮度。见图1。

图1 EPCs-EXOs镜下形态(透射电镜)

2.2 EPCs-EXOs标志蛋白表达

与EPCs相比，EPCs-EXOs中CD63和CD81呈强阳性表达，相对表达量均显著高于EPCs(P<0.01)，见图2、表1。

图2 EPCs和EPCs-EXOs标志蛋白CD63、CD81表达(Western blot)

表1 EPCs及EPCs-EXOs CD63、CD81的相对表达量

注：与EPCs比较，1)P<0.01

2.3 EPCs-EXOs对低氧条件下HUVECs增殖的影响

0h时各组细胞增殖差异无统计学意义(P>0.05)。24h时，与正常对照组比较，缺氧组细胞增殖率明显降低(P<0.05)；缺氧+EPCs-EXOs组细胞增殖率较缺氧组明显改善(t=5.96，P<0.01)，接近对照组水平(t=1.47，P>0.05)。48h时，各组间统计分析结果与24h相近(缺氧组vs正常对照组：t=5.51，P<0.05；缺氧+EPCs-EXOs组vs缺氧组：t=2.88，P<0.05；缺氧+EPCs-EXOs组 vs 正常对照组：t=0.45，P>0.05)，见表2。

表2 各组细胞相对增殖率

注：与正常对照组比较，1)P<0.05；与缺氧组比较，2)P<0.05，3)P<0.01

2.4 EPCs-EXOs减少低氧条件下HUVECs凋亡

0h时各组细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。24h时，与正常对照组比较，缺氧组HUVECs凋亡率明显增加(t=7.74，P<0.01)；与缺氧组比较，缺氧+EPCs-EXOs组HUVECs凋亡率显著下降(t=4.76，P<0.01)，但仍高于正常对照组(t=4.38，P<0.01)。48h时，各组间统计分析结果与24h相近(缺氧组vs正常对照组：t=16.12，P<0.01；缺氧+ EPCs-EXOs组 vs 缺氧组：t=14.12 ，P<0.01；缺氧+ EPCs-EXOs组 vs 正常对照组：t=5.83，P<0.01)。见表3及图3。

表3 各组细胞凋亡率比较

注：与正常对照组比较，1)P<0.01；与缺氧组比较，2)P<0.01

图3 各组HUVECs凋亡(流式细胞术)

2.5 EPCs-EXOs改善低氧条件下HUVECs的迁移能力

24h时，与正常对照组比较，缺氧组HUVECs迁移率明显降低(t=17.53，P<0.01)；与缺氧组比较，缺氧+EPCs-EXOs组HUVECs迁移率明显改善(t=8.91，P<0.01)，且与正常对照组差异不显著(t=0.55，P>0.05)。48h时，各组HUVECs爬片划痕宽度进一步减小，与正常对照组比较，缺氧组HUVECs迁移率明显降低(t=7.35，P<0.01)；缺氧+EPCs-EXOs组HUVECs迁移率仍明显高于缺氧组(t=7.84，P<0.01)，与正常对照组相比较无明显差异(t=0.58，P>0.05)。见图4及表4。

图4 各组细胞划痕实验

表4 各组细胞迁移率比较

注：与正常对照组比较，1)P<0.01；与缺氧组比较，2)P<0.01

3 讨 论

低氧可引起内皮细胞损伤，体外缺氧环境中培养的HUVECs增殖、迁移能力下降，凋亡细胞比例随着时间推移明显上升。本研究显示，在缺氧HUVECs中加入EPCs-EXOs，可以改善缺氧对HUVECs细胞增值和迁移能力的影响，并能抑制内皮细胞凋亡。这些结果表明EPCs-EXOs可减轻内皮细胞缺氧性损伤，具有一定的抗凋亡作用。

内皮细胞缺氧可发生在多种病理生理状态下，如冠状动脉粥样硬化引起的冠状动脉供血不足，脑血管栓塞引起的脑血管缺血，睡眠呼吸暂停综合征和慢性阻塞性肺部疾病引起的全身缺氧等，都对血管内皮细胞直接或间接造成缺氧，引起内皮细胞损伤。缺氧可以引起内皮细胞的炎症和氧化应激反应，从而导致内皮细胞损伤，并诱发凋亡[6]。内皮损伤是多种心脑血管疾病发生的关键环节，并与心脑血管疾病形成恶性循环，随着心脑血管疾病的进展，内皮损伤日趋加重，继而进一步促进心脑血管疾病的发展，最终引起致死性疾病的发作。

基于干细胞的心脑血管疾病治疗曾经给研究者带来曙光。EPCs是内皮细胞的前体细胞，可以分化成为成熟的内皮细胞，对血管新生和再生有直接作用，还可通过旁分泌的方式的促进血管细胞增殖和迁移，从而刺激新生血管的形成。但应用到临床上因为免疫排异、染色体差异和栓塞形成等问题，受到极大的局限[7]。研究发现，EPCs还可通过分泌细胞因子实现功能，这与EPCs改变靶细胞所处的微环境有关，近年的研究更是发现EPCs的旁分泌机制在血管新生和再生中更为重要[8]。EXOs作为一种重要的旁分泌方式，可以通过转运遗传物质和蛋白分子到靶细胞，在细胞间信息传输方面起着关键作用。EPCs的免疫原性主要来自其大分子蛋白和多糖等成分，而EXOs的内容物以小分子为主，且主要是不具有免疫原性的核酸分子，故EXOs虽具有来源细胞的相似功能特性，但不具有免疫、血管栓塞等方面的副作用，提示使用EXOs可能是一种比干细胞移植更安全的治疗模式[9]。

本文提取了EPCs分泌的EXOs，并将其用来干预缺氧的内皮细胞。本文研究结果显示，当细胞缺氧处理24h后，其增殖和迁移能力下降，细胞凋亡水平增加。而在缺氧的内皮细胞中加入EPCs-EXOs时，缺氧的内皮细胞增殖和迁移能力有一定程度的恢复，其凋亡比例也出现下降，与正常组相比，其增殖、迁移能力相近。尽管外泌体处理后缺氧内皮细胞的凋亡比例稍高于正常对照组，但其凋亡仍得到了明显的减轻。

综上所述，在缺氧发生后，EPCs-EXOs可以改善内皮细胞活性，减轻内皮细胞的缺氧性损伤，具体的调节分子机制尚待进一步研究阐明。

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