凝血因子Ⅸ基因新发错义突变致乙型血友病一例家系分析

王京伟 李 艳 乔 斌 熊 亮

乙型血友病(Hemophilia B，HB)为凝血因子IX (Coagulation Factor 9，F9)基因缺陷引起的凝血障碍性出血性疾病，呈X连锁隐性遗传，男性发病率约为1/30 000，女性以携带者居多。约70%的患者有家族史，30%为散发病例。F9基因点突变是HB最主要的发病机制，占97%左右，大片段插入缺失约占3%。出血倾向的严重性与患者血浆中F9活性(FⅨ:C)水平相关，根据血浆中F9活性，HB可分为轻型(>5%)、中型(1%-5%)和重型(<1%)三种类型。轻型患者表现为外伤后出血难止，重型患者表现为自发性关节出血、肌肉出血和内脏器官出血等，具有高致残率和致死率。

HB目前尚无根治手段，临床多采用F9替代疗法，筛查F9基因突变，确定突变位点，可对HB进行快速准确的基因诊断。对HB患者及携带者进行准确、快速的基因诊断和产前干预，是防止新患儿出生、切断致病基因传递、提高人口素质，减轻社会负担最有效方法。本研究应用PCR-Sanger测序方法对HB患者进行F9基因检测，首次发现一例携带变异的HB家系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

先证者，男性，53岁，因牙龈出血就诊，曾多次关节及皮肤出血，以HB待查收入院。家族无近亲结婚史，家系遗传图谱见图1。经患者及患者家属知情同意后进行相关凝血指标及F9基因致病位点分析。本研究获得医院医学伦理学委员会批准，临床资料及标本采集均获患者知情同意。先证者母亲及女儿、外甥女无明显出血病史。

注：方形代表男性；圆形代表女性；圆形中间带黑点代表女性携带者；方形带斜线代表已去世男性；箭头代表先证者

图1 乙型血友病家系遗传图谱

1.2 主要试剂与仪器

全血基因组核酸提取及纯化试剂(上海星耀医学科技发展有限公司)，DNA凝胶回收试剂盒(Axygen公司)，ABI 3500测序仪Cathode Buffer Container、POP-7分离胶、ABI BigDyeTM终止剂(美国Applied Biosystems公司)，PCR clean up试剂盒(天根生化科技有限公司)，2×PCR mix buffer(Thermo公司)。Symex CS-5100全自动凝血分析及配套试剂、XE 2100型全自动血液分析仪及配套试剂(日本Sysmex公司)，9700型PCR仪、Smart LabAssist-32核酸自动纯化提取仪(台湾圆点奈米技术开发有限公司)，Nanodrop 2000 超微量分光光度计(美国NanoDrop 公司)，凝胶成像系统(BioSpectrum公司)，Sub-Cell GT Cell型水平电泳系统(BIO-BAD公司)。

1.3 常规指标检查

抽取先证者及其家系成员EDTA-K2抗凝静脉血2ml，采用全自动凝血分析仪及配套试剂检测检测活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、D-二聚体浓度及F9 活性，采用血液分析仪检测血红蛋白(Hb)水平。

1.4 F9基因测序及突变分析

1.4.1基因组DNA提取：采集受检者静脉血2ml，EDTA-K2抗凝，采用全血基因组核酸提取及纯化试剂提取基因组DNA，按试剂盒说明书进行操作。在96孔预装板的第1列和第7列加入全血样本400μl ，分别在提取反应板中第1列和第7列加入蛋白酶20μl，选择Smart LabAssist-32核酸自动纯化提取仪上相应的提取程序进行自动化核酸提取。运行结束后第5列和第11列对应槽位为相应标本提取的DNA。采用Nanodrop 2000 超微量分光光度计检测DNA浓度和纯度，使A260/280 在1.8-2.0，A260/230>2。根据定量浓度将DNA样本稀释至5-15ng/μl进行PCR扩增检测，DNA原液于-20℃保存。

1.4.2PCR扩增：分别针对F9基因的外显子及邻近内含子区域设计引物。引物参照Paez等[1]和Lynch等[2]设计，扩增片段为265-795bp，引物由上海Invitrogen公司合成，引物序列及相关信息见表1。首轮PCR 总反应体系为25μl，包括模板DNA 2μl，2×PCR mix buffer 12.5μl，终浓度为5μmol/L 的上、下游引物各2μl，ddH2O补足至25μl。循环参数：95℃ 预变性5min；95℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 1min，共35个循环；72℃延伸5min。PCR产物经2g/L 琼脂糖凝胶电泳鉴定，采用凝胶成像系统拍照成像，验证PCR扩增产物是否为目的片段。

表1 F9基因不同外显子扩增引物信息

1.4.3PCR产物回收：紫外灯下切下目的DNA条带，采用Axygen DNA凝胶回收试剂盒回收DNA，-20℃保存备用。

1.4.4测序反应：取 BigDye缓冲液1.15μl，BigDye 0.3μl，待测DNA 1μl，正反向引物各1μl，灭菌去离子水补体积为6μl。PCR扩增条件：98℃预变性2min；96℃10s，50℃5s，60℃4min，25个循环。然后置4℃保存。PCR产物中加入16μl醋酸钠/乙醇混合液，充分振荡，4℃离心后弃上清液；加70%(v/v)乙醇70μl洗涤沉淀2次。室温干燥沉淀后加10μl的甲酰胺充分溶解DNA，在PCR仪上95℃热变性2min，冰中骤冷待用。将纯化后测序反应产物在ABl 3500dx型测序仪上进行测序，按仪器说明书操作。电泳结束后仪器自动分析彩色测序图谱，其DNA最低检出浓度为20-40ng/L。

1.4.5基因序列分析：经BLAST软件比较分析测序结果与NCBI genebank数据库中F9序列(NG_007994.1)的差异，分析F9基因是否存在突变位点。

2 结 果

2.1 凝血指标检测结果

先证者Hb含量降低，凝血功能示APTT延长，D-二聚体增高，F9活性明显下降，属于重型HB；先证者母亲及女儿APTT及F9活性分别有不同程度的延长和降低，Hb含量亦偏低，属于轻型HB；先证者父亲、哥哥和妹妹以及妻子APTT及F9活性正常。详见表2。

表2 先证者级家系成员实验室检测结果

2.2 F9基因序列结果分析

将先证者F9基因的测序结果与NCBI genebank数据库中F9序列(NG_007994.1，hg38版本)进行比对，发现其第4外显子区域存在c.289T>G(p.Cys97Gly)半合子错义突变，测序原始序列见图2。进一步检测患者其他家系成员该位点变异情况，发现患者母亲及女儿为c.289T>G杂合变异，其余家庭成员为野生型。HGMD数据库收录了该位点4个变异(c.289T>A[3]、c.289T>C[4]、c.290G>A[5]、c.291T>G[6])。

图2 F9基因c.289T>G位点变异测序结果

3 讨 论

HB又名血浆凝血活酶成分(PTC)缺乏症或F9缺乏症。此型临床表现酷似甲型，但发病率较低，遗传方式亦为X连锁隐性遗传，由于杂合子F9活性仅为正常 1/3，某些杂合子可出现症状，故HB女性患者较甲型多见。HB患者多因长期反复的关节内出血，而形成关节畸形(双侧膝关节，踝关节及肘关节明显)，活动力减低，严重影响患者的生活能力及生活质量。人类F9基因定位于Xq26.3-27.2，全长34kb，由8个外显子和7个内含子以及侧翼顺序中调控区域构成。F9基因mRNA全长2804bp，翻译为含461个氨基酸残基的蛋白质，主要有6个结构域构成，分别为信号肽和前肽区、γ-羧基谷氨酸区(GLA区域)、两个表皮样生长因子区(EGF区域)、激活肽区及催化区，其中GLA 区域由12个γ-羧基谷氨酸残基组成，F9通过该结构域与钙离子形成钙桥连接并与磷脂表面相连。EGF区域分为EGF-1区和EGF-2区，EGF-1区域可与钙离子紧密结合，EGF-1区被认为在F9被FVIIa-TF复合物激活及F9与FVIIIa 的结合中发挥重要作用[7]。EGF-2结构域内的Gln97、Phe98、Tyr115 及Leu117等4 个氨基酸位点对F9的分泌起着至关重要的作用[8]。目前为止F9基因已鉴定出的变异有1200多种，主要为错义突变、无义突变及小的插入和缺失等，其中错义突变和无义突变约占60%。除polyA区域外，F9基因突变在其它区域均有发生，其中第1、3、7外显子发生突变频率较低，第4和第8外显子的突变频率相对较高，属于热点区域，本家系中检测的c.289T>G变异便位于第4外显子，c.289T>G(p.Cys97Gly)位点变异在gnomAD、ExAC、1000g和ESP6500等人群频率数据库中均未被收录，为罕见变异。F9基因突变中调节区域的致病突变目前发现有28种，基因重排导致HB的有13种。有研究表明调节区的致病性变异，尤其是位于启动子区域的变异多表现为儿童期有严重出血倾向，青春期后自发出血减轻，后证实与雄性类固醇表达量有关[9]，雄性类固醇可诱导启动子产生F9，由此可见，临床症状轻重与突变性质或突变位置有一定关系。HB的临床治疗除对症治疗外多采用输血浆或浓缩血浆制剂等，将F9因子活性提高到25%以上即视为治疗有效。产前诊断是防止本病患儿出生的有效方法。近年，复旦大学有研究团队[10，11]在F9缺乏症的基因治疗方面取得了进展，有望在临床取得长期稳定疗效。

本研究发现一例F9基因新发变异的HB家系，根据美国医学遗传学与基因组学学会(The American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)制定的序列变异解读指南[12，13]，F9基因的97密码子区域被视为热点区域(Hot Spot)，位于该结构域内密码子对蛋白质功能起关键作用，如果在这些结构域上发现的所有错义突变均已被证实为致病突变(见表3)，且这些结构域中一定没有已知的良性突变，则该区域内新变异c.289T>G可作为致病的中等证据(PM1)。因c.289T>G变异在所有人群中等位基因的频率均不存在，ESP数据库、千人数据库、EXAC数据库中正常对照人群中均未发现该变异，符合中等致病性证据(PM2)，多种功能预测软件预测该变异会对基因或基因产物造成有害的影响，符合PP3证据，患者临床表型符合HB，为PP4证据，该变异在患者家系中实现了共分离，为PP1证据。综合考虑F9基因的c.289T>G位点变异归为可能致病性变异。

目前国内外已有报道少数病例的女性HB患者，其发病机制主要是X染色体的莱昂化作用导致X染色体的非随机失活或X染色体的结构异常(如唐氏综合征)，少见的发病机制是 F9 基因的纯合突变，而后者多来自于携带有致病基因的近亲结婚的家庭[14]。近亲结婚在亚洲国家还比较常见，会增加疾病的发病率，特别是HB等性染色体连锁的遗传性疾病。因此避免近亲结婚，同时对HB的女性携带者进行孕前筛查及产前诊断是降低血友病患儿出生率的根本措施，对于提高人口素质、减轻家庭及社会负担具有重要意义。

综上所述，本文通过分析一例HB先证者及其家系成员F9基因序列，首次发现第4外显子区域存在c.289T>G(p.Cys97Gly)半合子错义突变，可能为HB致病性突变。F9基因序列分析对于携带者筛查，疾病的诊断具有重要意义，对HB的基因治疗具有重要的指导意义。

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