miR-144靶向Bcl-2抑制儿童急性淋巴细胞白血病细胞增殖并促进凋亡的分子机制研究

魏 伟 杜建慧 朱 航 李俊兰 吴 莹

儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)为儿童常见的恶性肿瘤，其发病率呈逐年增加趋势[1]。由于早期诊断和治疗策略的进步，近10年间其5年生存率从50%上升到90%。但仍有部分患者存在预后不良或复发[2-4]。因此，目前仍需要有效的药物防治儿童ALL。miRNAs为一类长度为19-25个核苷酸组成的非编码小RNA分子,其通过抑制靶基因mRNA的翻译调控基因表达。miR-144与肺癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌等多种癌症均有关[5,6],也有报道显示，miR-144在儿童ALL中低表达[7]，但其具体作用机制尚未完全清楚。细胞凋亡是调节体内细胞新陈代谢平衡的生理机制，凋亡障碍是肿瘤发生的重要分子机制之一[8]。大量研究已证实，Bcl-2作为抑凋亡因子在很多肿瘤中发挥作用[9]。有研究报道，Bcl-2在B细胞慢性淋巴细胞白血病中高表达[10]，但其在儿童ALL中的作用机制尚未完全清楚。本研究将检测非恶性血液病患儿骨髓组织、ALL患儿骨髓组织、人T淋巴细胞白血病细胞(CEM/C1细胞)及其它ALL癌细胞珠(MOLT-4细胞和CCRF-CEM细胞)中miR-144、Bcl-2的表达，观察过表达miR-144、沉默Bcl-2、过表达Bcl-2对CEM/C1细胞增殖、凋亡的影响，并初步探讨其作用机制，为儿童ALL的治疗提供新靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和仪器

CEM/C1(编号：CVCL_3496)、MOLT-4(编号：CVCL_0013)、CCRF-CEM(编号：CVCL_0207)购自ATCC；miR-NC、miR-144 mimics、inhibitor NC、miR-144 inhibitor、si-NC、si-Bcl-2、pcDNA 3.1质粒均由自北京金唯智公司设计合成；Annexin V- /FITC凋亡检测试剂盒(货号:SU3616)购自上海蔚霆生物科技有限公司；RIPA蛋白裂解液(货号:116KDl27)、RPMI1640培养基(货号:C22400500BT)、胎牛血清(货号:F9423)均购自美国Sigma公司；脂质体LipofectamineTM2000(货号:11668-027)购自Invitrogen公司；逆转录试剂盒(货号:K1622)购于大连Takara公司；MTT检测试剂盒(货号：M1020)购自武汉艾美捷科技有限公司；Bcl-2蛋白Western blot检测试剂盒(货号：SNM464)购自北京百奥莱博科技有限公司。

1.2 组织、细胞分组与处理

1.2.1未转染细胞培养与分组：用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，于37 ℃，5%CO2的培养箱中常规培养CEM/C1细胞(CEM/C1组)、MOLT-4细胞(MOLT-4组)、CCRF-CEM细胞(CCRF-CEM组)。每2-3天更换培养液或消化传代一次。本院确诊的20例ALL患儿骨髓组织为ALL组，10例非恶性血液病患儿骨髓组织为Normal组。

1.2.2CEM/C1细胞质粒转染与分组：将miR-NC、miR-144 mimics、inhibitor NC、miR-144 inhibitor、si-NC、si-Bcl-2、miR-144+pcDNA 3.1、miR-144+pcDNA 3.1-Bcl-2用脂质体法转染CEM/C1细胞，分别标记为miR-NC组、miR-144组、inhibitor NC组、miR-144 inhibitor组、si-NC组、si-Bcl-2组、miR-144+Vector组、miR-144+Bcl-2组。转染成功后，用于后续实验。

1.3 观察指标及检测方法

1.3.1MTT实验检测细胞增殖率：取适量1.2.2各组细胞，分别培养0h、24h、48h、72h，加入20μl(5g/L)MTT溶液，常规培养4h，弃去上清，再加入150μl DMSO，震荡使结晶溶解，在490nm波长下测量细胞吸光度值(A)；每组设5个重复孔。细胞增殖率(%)=[A490样品/A490对照-1] ×100 %。

1.3.2qRT-PCR实验检测miR-144、Bcl-2 mRNA水平：取适量细胞，Trizol法裂解细胞，RNA抽提试剂盒提取RNA并定量。立即用逆转录试剂盒合成cDNA,采用qRT-PCR试剂盒进行miR-144、Bcl-2 mRNA水平检测，所有操作严格按试剂及仪器说明书进行，以GAPDH、U6作为内参，用2-△△Ct法计算定量结果。实验重复3次。

1.3.3Western blot实验检测Bcl-2蛋白：取适量细胞或骨髓液，用RIPA裂解后，提取总蛋白，BCA法蛋白定量后变性，然后进行SDS蛋白电泳，之后进行PVDF转膜，脱脂奶粉封闭2h后加入Ⅰ抗(1∶500)4℃孵育过夜。次日，洗膜后用辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗(1∶1 000)37 ℃孵育2h。结束后加入显影混合液，显影曝光。β-actin为内参，以Bcl-2与β-actin条带灰度值的比值表示Bcl-2蛋白的相对表达水平。

1.3.4流式细胞术检测细胞凋亡：取适量1.2.2各组细胞，用预冷的 PBS 洗涤3 次，结合缓冲液(500μl)悬浮细胞，加5μl Annexin V-/FITC和5μl PI(20mg/ml)，混匀，室温避光15min。每个样品重复3次。第二象限PI染色的细胞为晚期凋亡细胞，第一象限Annexin V染色的细胞为早期凋亡细胞。细胞总凋亡率(%)=早期凋亡率(Annexin V+/PI-)+晚期凋亡率 (Annexin V+/PI+)。

1.3.5双荧光素酶报告基因检测细胞荧光素酶活性：取对数生长期1.2.2各组细胞，用Trizol裂解液裂解，再加入5μl细胞裂解液、萤火虫缓冲液及5μl底物，混匀检测荧光强度。之后加入海肾荧光素酶缓冲液和5μl腔肠素底物，混匀检测海肾荧光素酶活性。psiCHECK2载体以萤火虫荧光素酶活性为内参，psiCHECK2-Bcl-2-3’UTR WT和psiCHECK2-Bcl-2-3’UTR MUT表达为对照，观察miR-144对Bcl-2表达的影响。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 各组miR-144、Bcl-2mRNA和蛋白表达水平比较

与Normal组相比，ALL组Bcl-2蛋白和Bcl-2 mRNA显著升高，miR-144水平显著降低，差异均有统计学意义(P<0.01)，见图1、表1。其它各组癌细胞珠miR-144、Bcl-2蛋白和Bcl-2 mRNA表达差异均有统计学意义(P<0.01)；与CEM/C1组相比，MOLT-4组、CCRF-CEM组细胞中Bcl-2蛋白和Bcl-2 mRNA均显著降低，miR-144水平均显著升高(P<0.01)；与MOLT-4组相比，CCRF-CEM组细胞中Bcl-2蛋白和Bcl-2 mRNA显著升高，miR-144水平显著降低(P<0.01)，见图1、表2。故选miR-144表达最少、Bcl-2蛋白和Bcl-2 mRNA最高的CEM/C1细胞做后续实验。

图1 癌组织和细胞中Bcl-2蛋白表达(Western blot)

表1 Normal 组和ALL 组骨髓组织miR-144、Bcl-2 mRNA及蛋白相对表达水平

注：与Normal 组比较，1)P<0.01

表2 各组癌细胞miR-144和Bcl-2相对表达水平

注：与CEM/C1组比较，1)P<0.01；与MOLT-4组比较，2)P<0.01

2.2 过表达miR-144对癌细胞增殖和凋亡的影响

与miR-NC组相比，miR-144组miR-144水平显著升高，在24h、48h、72h细胞增殖均显著降低，细胞凋亡率显著升高，差异均具有统计学意义(P<0.01)。见图2、表3。

2.3 miR-144靶向Bcl-2

通过miR-code预测到miR-144与Bcl-2存在结合位点，互补序列见图3。miR-NC组、miR-144组、inhibitor NC组、miR-144 inhibitor组Bcl-2蛋白表达水平以及细胞荧光素酶活性差异均有统计学意义(P<0.01)。与miR-NC组相比，miR-144组Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.01)；与inhibitor NC组相比，miR-144 inhibitor组Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.01)，见图4、表4。与miR-NC组相比，miR-144组细胞Bcl-2(WT)荧光素酶活性显著降低(P<0.01)，与inhibitor NC组相比，miR-144 inhibitor组细胞Bcl-2(WT)荧光素酶活性显著升高(P<0.01)，见表4。

图2 流式细胞术检测CEM/C1细胞凋亡率

表3 miR-144过表达对CEM/C1细胞增殖和凋亡影响

注：与miR-NC组比较，1)P<0.01

图3 miR-144靶向Bcl-2(互补序列)

图4 不同处理组CEM/C1细胞中Bcl-2的蛋白表达

表4 miR-144靶向Bcl-2对CEM/C1癌细胞Bcl-2蛋白表达及荧光活性的影响

注：与miR-NC组比较，1)P<0.01；与inhibitor NC组比较，2)P<0.01

2.4 沉默Bcl-2对CEM/C1癌细胞增殖和凋亡的影响

与si-NC组相比，si-Bcl-2组细胞Bcl-2 mRNA和蛋白表达均显著降低(P<0.01)，见图5、表5。与si-NC组相比，si-Bcl-2组细胞24h、48h、72h时细胞增殖率显著降低，细胞凋亡率显著升高(P<0.01)，见图6、表5。

图5 敲除Bcl-2后CEM/C1细胞Bcl-2蛋白表达(Western blot)

表5 敲除Bcl-2后CEM/C1细胞Bcl-2 mRNA相对表达及增殖和凋亡水平

注：与si-NC组比较，1)P<0.05

图6 敲除Bcl-2后CEM/C1细胞凋亡率(流式细胞术)

2.5 过表达Bcl-2逆转miR-144对CEM/C1的增殖和凋亡

miR-NC组、miR-144组、miR-144+Vector组、miR-144+Bcl-2组细胞增殖率和细胞凋亡率差异均有统计学意义(P<0.01)。与miR-NC组相比，miR-144组在24h、48h、72h时细胞增殖率显著降低，细胞凋亡率显著升高(P<0.01)；与miR-144+Vector组相比，miR-144+Bcl-2组在24h、48h、72h时细胞增殖率显著升高，细胞凋亡率显著降低(P<0.01)。见图7、表6。

图7 不同处理组CEM/C1细胞凋亡率(流式细胞术)

表6 miR-144靶向Bcl-2调控CEM/C1的增殖和凋亡

注：与miR-NC组比较，1)P<0.05；与miR-144+Vector组比较，2)P<0.05

3 讨 论

miRNA为可调控参与药物转运、代谢及靶向[11]的基因，并影响疾病的治疗效果[12]。例如，miR-125b、miR-99a和miR-100上调与抗肿瘤药物长春碱、柔毛霉素的耐药性有关，miR-708下调与儿童B-ALL中对糖皮质激素的耐药性有关[13,14]。miR-144在多种癌症中均可作为抑癌基因发挥作用，如其可通过靶向SMAD4抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭[15]，通过靶向IRS1抑制喉部鳞状细胞癌的生长和转移[16]。Ding等[7]研究发现，老年B淋巴瘤小鼠miR-144/451表达下调，且此变化可激活原癌基因c-Myc，c-Myc又可结合miR-144/451启动子区域反向调节miR-144/451表达，形成miRNA-Myc阳性反馈环以形成B淋巴细胞中高水平的c-Myc，揭示下调miR-144/451可能通过激活沉默的c-Myc而利于B淋巴瘤的发生发展。Jin等[17]在儿童ALL的研究中，运用qRT-PCR检测ALL细胞Molt-3、Molt-4、Tall-104、Jurkat、CCRF-CEM、CEM/C1、CEM/C2中miR-144 mRNA表达并通过慢病毒转导上调或下调miR-144，运用MTT法、流式细胞术检测干预miR-144的Molt-3、Jurkat细胞增殖、细胞周期发现，白血病组织及细胞中miR-144表达水平下降，且上调miR-144可抑制ALL增殖和细胞周期转变，上调miR-144对ALL无影响，运用双荧光素酶报告基因检测实验验证了FMN2基因是miR-144的靶标。

本研究检测了Normal组、ALL组、CEM/C1组、MOLT-4组、CCRF-CEM组中miR-144的表达发现，ALL组及癌细胞组miR-144表达下调；运用MTT法、流式细胞术检测miR-144组、si-Bcl-2组、miR-144+Bcl-2组CEM/C1细胞的增殖、凋亡发现，过表达miR-144、沉默Bcl-2均可抑制CEM/C1细胞增殖、促进凋亡，且过表达Bcl-2可逆转miR-144对CEM/C1细胞的抑制增殖、促进凋亡作用；进一步用双荧光素酶报告基因检测实验验证了Bcl-2为miR-144的靶标。Bcl-2为凋亡抑制因子，其主要功能为调节细胞的凋亡进程，特别是癌症细胞[18,19]。据报道，Bcl-2在人类的很多肿瘤中均具有重要的调控作用，包括儿童ALL[20]。李焱等[21]在儿童ALL的调查中运用RT-PCR检测了急性白血病患儿和对照患儿WT1表达，免疫荧光流式细胞术检测急性淋巴细胞白血病患儿Bcl-2的表达发现，WT1、Bcl-2表达均上调。本研究检测了Normal组、ALL组、CEM/C1组、MOLT-4组、CCRF-CEM组中Bcl-2的表达发现，Bcl-2在ALL脊髓中表达上调；运用MTT法、流式细胞术检测si-Bcl-2组、miR-144+Bcl-2组CEM/CI细胞增殖、凋亡发现，Bcl-2可抑制CEM/CI细胞增殖、促进凋亡，且过表达Bcl-2可逆转miR-144对CEM/CI细胞的增殖抑制，凋亡促进作用，这说明不仅miR-144可靶向Bcl-2调控细胞增殖凋亡，相反，Bcl-2也可逆向调控miR-144的表达及功能。这些结果为儿童ALL的靶向治疗提供更充分的理论依据，更为miR-144在ALL病中的治疗奠定理论基础。

综上所述，miR-144可抑制儿童ALL细胞增殖，并促进凋亡，其机制可能与靶向Bcl-2有关，该结果为儿童ALL的靶向治疗提供了新靶点。

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