黄连素对阿尔兹海默症大鼠学习记忆功能及海马组织GSK3β、p-Tau蛋白表达的影响

周晶 董笑克 马青科 金香兰 张志辰

阿尔兹海默症(alzheimer’s disease，AD)是一种在全球范围内常见的神经退行性疾病，患者表现为记忆缺失、语言、定向力障碍、幻觉等，患者及家属的生活质量严重降低。目前，尚无有效的药物预防或逆转AD的发展。研究发现，淀粉样蛋白-β(amyloid-beta ，Aβ)激活丝氨酸蛋白激酶3β(serine protein kinase 3 β，GSK3β)，上调的微管相关蛋白Tau蛋白过度磷酸化，是AD发病关键环节。中草药及其提取物对AD的治疗具有一定的优势，中药抗AD有效物质的筛选及其机制研究是AD治疗研究的重点。中药黄连提取物黄连素具有抗炎、抗氧化等作用，可有效地改善大鼠认知缺陷和记忆力。为了进一步探究黄连素治疗AD的机制，本研究旨在通过阿尔兹海默症大鼠模型，探究不同剂量黄连素对大鼠学习和认知功能的影响，并通过对AD发病的关键蛋白GSK3β、p-Tau表达量的检测，阐释黄连素治疗AD的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性wistar大鼠62只，6周龄，体重(220±20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证编号：SYXK(京)：2019-0013。饲养于北京中医药大学东方医院动物中心，饲养级别为SPF级，5只/笼，保证正常光照节律、温度适度、环境安静，正常大鼠生长繁殖饲料饲养，自由进食和饮水。

1.2 药物及试剂

盐酸小檗碱(黄连素)，成都锦华药业有限公司生产，批号：180613；Aβ25-35，美国Sigma公司生产，批号：053M4804V，注射前用生理盐水将Aβ25-35配制为10 μg/μL的溶液，在37℃ 孵育1周；重组Anti-GSK3 beta抗体(Y174)，abcam公司，货号：ab32391；重组Anti-Tau (phospho S396)抗体，abcam公司，货号：ab109390。

1.3 主要试验仪器

WMT-100 Morris水迷宫视频跟踪系统，成都泰盟科技有限公司；大鼠数显脑立体定位仪，北京众实迪创科技发展有限公司，规格：ZS-B/S；微量注射针Trajan Scientific and Medical(SGE)，规格：10 μL；实验动物饮水机(MN-LM500J)，北京木牛流马净化工程技术有限公司；SDS-PAGE电泳系统，美国BIO-Rad公司；凝胶成像系统，美国UVP公司。

1.4 造模与给药方法

所有大鼠适应性饲养一周后，随机分为假手术组、模型组，黄连素低剂量组、黄连素中剂量组、黄连素高剂量组，假手术组10只，其余每组各13只。假手术组大鼠注射生理盐水，其余各组大鼠腹腔注射D-半乳糖，100 mg/kg，每日1次，共注射6周。连续注射D-半乳糖2周后，黄连素低、中、高剂量组分别给予黄连素50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg灌胃，其余大鼠给予等体积生理盐水灌胃，干预4周。注射第3周时，1%戊巴比妥钠腹腔注射40 mg/kg麻醉大鼠。在大鼠脑立体定位仪下，自颅顶前囟向后4.4 mm、旁开 2.2 mm，硬脑膜下3.0 mm，微量注射泵缓慢注射Aβ25-3510 μg于一侧海马，留针5分钟，同样方法将等剂量Aβ25-35注入对侧海马[1]。假手术组大鼠同方法注射等量生理盐水。注射后大鼠伤口缝合，术区消毒。术后每天碘伏伤口消毒，连续3天。造模7天后进行水迷宫学习记忆能力测试，以第5天假手术组大鼠逃避潜伏期均值为参考值，若各造模大鼠平均逃避潜伏期与参考值之差占该鼠平均逃避潜伏期的比值>20%则表示造模成功[2]。模型组和黄连素低、中、高剂量组各有3只造模失败，剔除。

1.5 观察指标与检测方法

1.5.1 Morris水迷宫实验 大鼠药物干预4周后，进行为期7天的Morris水迷宫行为学检测，其中第1～6天为定位航行实验，第7天为空间探索实验。第1～2天进行训练，每日上午、下午(间隔两小时以上)固定时间训练，记录大鼠找到平台所需时间，即逃避潜伏期，并记录大鼠线路图、总路程等。若大鼠90秒内不能找到平台，将其引导至平台，在平台停留15秒后放回笼中，记录该大鼠的逃避潜伏期为 90秒。第3～6天，在固定时间将大鼠背对平台分别从对侧象限及相邻象限放入池中，每天两次，记录逃避潜伏期。第7天，撤掉平台，将大鼠从对侧象限放入水池，记录90秒内大鼠穿越原平台位置次数、中心区域值、中环区域值等。

1.5.2 海马组织GSK3β及p-Tau蛋白表达 水迷宫结束后，各组大鼠麻醉，取双侧新鲜海马迅速冻存于液氮中，进行Western Bolt检测。实验流程见图1。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各组阿尔兹海默症大鼠死亡情况

术后模型组、黄连素低、高剂量组各死亡1只，死亡原因为手术损伤。

2.2 各组阿尔兹海默症大鼠Morris水迷宫实验结果分析

2.2.1 游泳路径图 对比各组大鼠游泳路径线路图(见图2)，假手术组以趋向式、直线式为主，模型组以随机式、边缘式为主，黄连素低剂量组以随机式、趋向式为主，黄连素中剂量组以趋向式、随机式为主，黄连素高剂量组以趋向式、直线式为主。

2.2.2 定位航行实验 取第6天各组大鼠两次逃避潜伏期、总路程平均值进行分析。与假手术组相比，模型组、黄连素低中剂量组逃避潜伏期、总路程显著增加(P<0.01)，与模型组相比，黄连素高剂量组逃避潜伏期、总路程显著降低(P<0.01)。见表1。

表1 各组阿尔兹海默症大鼠定位航行实验逃避潜伏期、 总路程对比

注： 与假手术相比，aP<0.05，bP<0.01；与模型组相比，cP<0.05，

dP<0.01。

2.2.3 空间探索实验 各组大鼠第一次穿越目标区域时间对比：与假手术组相比，其余四组第一次穿越目标区域时间均显著增高(P<0.01)，与模型组相比，黄连素中、高剂量组第一次穿越目标区域时间降低(P<0.05，P<0.01)。各组大鼠中心区域值无显著差异(P>0.05)。各组大鼠中环区域对比：模型组、黄连素中高剂量组中环区域显著低于假手术组(P<0.01，P<0.05)，与模型组相比，低剂量组中环区域数值增加(P<0.05)。各组大鼠穿越目标区域次数对比：模型组、黄连素低剂量组穿越次数显著低于假手术组(P<0.01)，与模型组相比，黄连素中、 高剂量组穿越次数显著增加(P<0.05，P<0.01)。

2.3 各组阿尔兹海默症大鼠海马组织GSK3β、p-Tau蛋白表达

各组大鼠海马组织GSK3β蛋白表达：与假手术组相比，其余各组GSK3β蛋白表达均显著升高(P<0.01)；与模型组相比，黄连素中、高剂量组GSK3β蛋白表达下降(P<0.05，P<0.01)。各组大鼠海马组织p-Tau蛋白表达：与假手术组相比，模型组、黄连素低、中剂量组p-Tau蛋白表达均显著升高(P<0.01)；与模型组相比，高剂量组p-Tau蛋白表达下降(P<0.05)。见图3、表3。

图1 实验流程图

注：A 假手术组；B模型组；C 黄连素低剂量组；D 黄连素中剂量组；E 黄连素高剂量组。

图2各组大鼠游泳轨迹图

表2 各组阿尔兹海默症大鼠空间探索实验分析

注： 与假手术相比，aP<0.05，bP<0.01；与模型组相比，cP<0.05，dP<0.01。

表3 各组阿尔兹海默症大鼠GSK3β、p-Tau蛋白 表达结果比较

注： 与假手术相比，aP<0.05，bP<0.01；与模型组相比，cP<0.05，

dP<0.01。

注：A假手术组；B模型组；C黄连素低剂量组；D黄连素中剂量组；E黄连素高剂量组。

图3各组阿尔兹海默症大鼠脑组织GSK3β、p-Tau蛋白表达

3 结论

阿尔兹海默症是全球痴呆最常见的类型，约占痴呆症主要原因的70%[3]，全球约有4000万人患有AD，并且AD的患病率逐年上涨[4]。AD患者自身承受着巨大的痛苦，此外，对于家庭和社会都造成了巨大的经济负担。AD典型病理改变为脑组织中大量Aβ斑块的积累[5]，以及神经细胞内产生神经纤维缠结(neurofilament tangle，NFT)。目前认为其产生机制主要为Aβ抑制AKT的磷酸化[6]，从而减少GSK-3磷酸化失活，增加活性的GSK-3，促进Tau过度磷酸化，从微管脱离，导致微管结构不稳定，最终形成AD的标志性物质NFT[7]。基于此，学者提出GSK3是Aβ和tau桥梁[8]。针对于Aβ研发的靶向药物都以失败告终，研究发现，影响AD进展的主要因素是Tau而不是Aβ[3]。因此，寻找选择性抑制GSK3的药物有望有效延缓AD进展，是目前AD治疗的热点。

阿尔兹海默症属中医“呆病”“痴呆”“善忘”等范畴，多认为其与痰浊、瘀血、肾虚、抑郁及情志因素密切相关。部分学者提出痴呆与“热”“毒”有关，并用清热解毒法治疗痴呆取得了良好的效果[9-10]。大量的临床及实验研究均证实了黄连解毒汤等清热解毒方剂及中药对痴呆的疗效[11-12]。此外，对中医治疗健忘或痴呆的中药方剂进行用药规律分析，发现重补虚药、安神药、清热药，其中清热药的核心药物为甘草、生地及黄连[13]。

黄连素是中药黄连的主要有效成分之一，除抗菌、抗炎、降糖、降脂、抗氧化、抗抑郁等作用之外，研究发现黄连素还有治疗阿尔兹海默症的潜力[14]。对记忆缺陷的动物，黄连素具有显著的改善大/小鼠记忆力的作用[15]。研究发现，黄连素可以减轻突触损伤[16]，通过部分抑制凋亡级联、神经炎症、氧化应激来部分改善LPS诱导的大鼠认知缺陷[17]。本研究中，通过Morris水迷宫实验发现，三种剂量的黄连素均能不同程度地改善阿尔兹海默症大鼠逃避潜伏期、中环区域比例、游泳距离等指标，其疗效与剂量呈正相关，150 mg/kg黄连素对大鼠学习及记忆能力改善更佳。对GSK3β、p-Tau蛋白表达的结果与行为学检测结果一致，150 mg/kg黄连素对GSK3β、p-Tau蛋白表达具有最强的下调作用。

综上所述，黄连素具有显著的改善阿尔兹海默症模型大鼠学习和记忆能力的作用，疗效与用量成正相关，其机制与黄连素降低活性GSK3β蛋白含量，抑制Tau磷酸化相关。