核桃青皮流浸膏对银屑病小鼠皮肤屏障功能的影响及机制研究

马婧怡 沈静 张万鑫 朱瑾 马祖文

银屑病俗称牛皮癣，病因尚不明确，现代研究认为与遗传、感染、免疫、精神、内分泌、外伤、饮食及代谢障碍等因素有关。有研究发现银屑病患者往往具有表皮细胞增殖加速，角化不全和真皮淋巴细胞浸润等变化，引起患者皮肤屏障功能受损，导致病情恶化。与皮肤屏障功能密切相关的物质主要包括水通道蛋白-3(aquaporin3, AQP3)、神经酰胺(ceramide , Cer)，丝聚合蛋白(filaggrin , FLG)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-14(caspase14)等。核桃属(Juglansregia)植物已经具有两千多年的栽培历史，富含大量糖类、蛋白质、氨基酸、无机盐、维生素、酚类、黄烷酮类和萘醌类等营养物质。核桃青皮(Walnutgreenhusk)是核桃壳外一层厚厚的绿色果皮，又叫青龙衣。核桃青皮既是珍贵的用材树种，又是重要的药源植物[1]。古代多篇文献记载了其药用价值：治水痢不止、病疡、嵌甲[2]、银屑病[3]、白癜风[4]、肝胃气痛、胃神经痛、急慢性胃痛等。鉴于核桃青皮的主要功效，同时新疆盛产核桃，主要分布在和田阿克苏等地，核桃青皮产量可观，而日常生活中核桃青皮均被废弃，因此本文主要分析银屑病动物模型皮损处与皮肤屏障功能密切相关的基因表达变化，阐明核桃青皮对银屑病小鼠皮肤屏障功能的影响及可能机制，为核桃青皮治疗和预防银屑病提供理论依据。

1 对象和方法

1.1 实验动物

Balb/c鼠，普通级，体重18～20 g，雌雄各半，购自新疆医科大学动物实验中心。

1.2 实验药物

核桃青皮采自新疆维吾尔自治区和田地区墨玉县扎瓦乡依格孜艾日克村；咪喹莫特乳膏，购自四川明欣药业有限责任公司；卡泊三醇软膏，购自爱尔兰利奥制药有限公司，批号：A70108。

1.3 实验仪器

显微镜E200(Nikon生物显微镜)；核酸蛋白定量仪K5500(北京凯奥)；电泳槽DYCZ-21(北京市六一仪器厂)；凝胶成像系统2500(上海天能)；MyCycler Thermal Cycler PCR仪(Bio-RadUSA)；ABI QuantStudioTM6 Flex Real-Time PCR Syste Real Time PCR instrument(ABI)。

1.4 核桃青皮浸膏的提取及流浸膏的制备

将核桃青皮干燥，粉碎成粉末，取100 g核桃青皮粉末，采用500 mL 95%乙醇回流的方法提取3次，每次3小时，抽滤，合并滤液，弃去滤渣，50℃减压旋蒸，得浓缩液，将浓缩液置于60℃水浴锅中干燥，得浸膏15 mL。准确称取醇提浸膏60 mL用适当75%乙醇溶解，定溶于100 mL容量瓶中，配成60%流浸膏备用，同样方法制成30%、15%流浸膏备用。

1.5 动物模型的制备、分组及给药

1.5.1 动物模型的制备 Balb/c鼠背部脊柱两侧去毛，去毛面积约为3 cm×3 cm，适应性生长3天后进入实验，使用5%咪喹莫特乳膏42 mg每日上午10:00涂于小鼠背部皮肤，1次/天，连续7天诱导银屑病。

1.5.2 动物分组 Balb/c鼠72只，分为模型组、核桃青皮流浸膏低、中、高剂量组、阳性药组以及假手术组，共6组，每组12只。除假手术组使用等量的凡士林涂抹，其余同模型制备。

1.5.3 动物给药 模型组涂抹生理盐水；核桃青皮流浸膏低剂量组涂抹15%核桃青皮流浸膏；核桃青皮流浸膏中剂量组涂抹30%核桃青皮流浸膏；核桃青皮流浸膏高剂量组涂抹60%核桃青皮流浸膏；阳性药组涂抹卡泊三醇软膏；假手术组涂抹生理盐水。各组小鼠每日下午18:00涂抹适量的药物，1次/天，连续10天。

1.6 检测指标及方法

1.6.1 银屑病评分 各组Balb/c鼠皮肤临床症状采用银屑病面积与严重程度指数(psoriasis area and severity index，PASI)评分标准，从红斑、鳞屑、皮肤厚度3项指标进行评价，以0～4分进行记分，将3者积分相加得到总积分。PASI评分标准如下：0分，无症状；1分，轻度；2分，中度；3分，重度；4分，极重度。由两名观察者采取盲法的方式进行肉眼观察，判断评价，并采用数码照相的方法进行记录。

1.6.2 组织病理学检查 颈椎脱臼处死小鼠后用眼科镊取背部皮肤损伤处组织，用10%(质量分数)甲醛溶液固定，石蜡包埋，进行常规HE染色，分别于200倍及400倍显微镜下观察皮肤组织病理变化。

1.6.3 RT-PCR检测 各组Balb/c鼠皮肤组织中AQP3、Cer、FLG、Caspasel4的基因表达：颈椎脱臼处死小鼠后用眼科镊取背部皮肤损伤处组织，皮肤组织置于研钵中液氮研磨后，参照TRLZOL试剂说明提取RNA，取800 ng RNA模板使用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，以1 μL cDNA为模板，上下游引物各0.7 μL，引物信息见表1，将反应体系置于ABI Real Time PCR instrument仪器中进行PCR扩增，按照以下条件进行两步法荧光定量PCR扩增：95℃预变性2分钟；95℃变性5秒，60℃退火及延伸30秒，共40个循环。得到CT值，参照2-△△CT方法计算各基因mRNA相对表达量。

表1 荧光定量检测引物信息表

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 各组Balb/c鼠皮肤PASI评分

各组Balb/c鼠皮肤给药10天后PASI评分见表2，其中模型组在给予咪喹莫特乳膏3天后出现明显红肿；4～5天受试皮肤出现明显增厚及鳞屑，随后皮肤损伤日益加重，直至第7天模型组Balb/c鼠受试皮肤出现结痂及白色斑块状鳞屑。阳性药及各浓度治疗组小鼠皮肤红肿的出现时间、出现鳞屑的面积大小，皮肤增厚的程度均轻于模型组。至第10天，阳性药及各浓度治疗组小鼠皮肤红肿程度轻、出现鳞屑的面积小，鳞屑少，皮肤增厚程度不明显，整体较为光滑，见图1。

表2 各组Balb/c鼠皮肤PASI评分

注： 与假手术组比较，aP<0.01。

注： A:模型组；B:核桃青皮流浸膏低剂量组；C:核桃青皮流浸膏中剂量组；D:核桃青皮流浸膏高剂量组；E:阳性药组；F:假手术组。

图1各组Balb/c鼠受试皮肤

2.2 各组Balb/c鼠皮肤组织的变化

HE染色结果显示，模型组：镜下表皮增厚伴角化过度及角化不全，棘层增厚，部分表皮突延长，真皮乳头水肿伴血管扩张，血管周围见少量淋巴细胞及中性白细胞浸润，部分区域可见Munro微脓肿，部分区域可见表皮溃疡形成。核桃青皮流浸膏低剂量组：镜下表皮增厚伴角化过度，棘层增厚，真皮乳头水肿伴血管扩张，血管周围见少量淋巴细胞及中性白细胞浸润，部分区域可见表皮溃疡形成。核桃青皮流浸膏中剂量组：镜下表皮增厚伴角化过度，棘层增厚，真皮乳头水肿伴血管扩张，血管周围见少量淋巴细胞及中性白细胞浸润。核桃青皮流浸膏高剂量组：镜下表皮轻度增生伴角化过度，棘层轻度增厚，真皮层轻微水肿，少量淋巴细胞及中性白细胞浸润。阳性药组：镜下表皮轻度增生伴角化过度，棘层轻度增厚，真皮层轻微水肿，少量淋巴细胞浸润。假手术组：镜下表皮层菲薄，未见明确异常。见图2。

2.3 各组Balb/c鼠皮肤组织中Cer、AQP3、Caspase14、FLG的基因表达

与假手术组相比，模型组、核桃青皮流浸膏低剂量组、中剂量组受试皮肤组织中的AQP3、Cer、FLG、Caspase14表达明显下降(P<0.01)；与模型组相比，各组受试皮肤组织中的AQP3、Cer表达明显升高(P<0.01)，核桃青皮流浸膏中剂量组、高剂量组、阳性药组、假手术组FLG、Caspase14表达明显升高(P<0.01)；与阳性药相比，模型组、核桃青皮流浸膏低剂量组、中剂量组受试皮肤组织中的AQP3、Cer、FLG、Caspase14表达明显下降(P<0.01)。见表3。

3 讨论

古代多篇文献记载了核桃青皮的药用价值，但对它治疗银屑病的研究仍十分有限。AQP是哺乳动物细胞膜上与水的通透性相关的蛋白，起调节细胞内外水代谢的平衡作用，分十多种亚型，存在于人体皮肤的细胞膜上表达最多的一种水通道蛋白亚型是AQP3， 其主要作用是跨膜转运水分、 甘油、尿素等物质以调节皮肤的水平衡，有保湿作用，参与皮肤水合作用，构成并调节皮肤屏障功能，保持正常皮肤的功能和形态，参与角质形成细胞的分化，有学者发现AQP3与湿疹、银屑病等多种皮肤屏障功能相关的皮肤病发病机制相关[5]。Cer是人体皮肤角质层细胞间混合脂类物质的主要成分，对水分散发和外界刺激有防护作用，能够滋润皮肤、抗衰老、抗过敏，还有融合角质层蛋白质形成皮肤屏障的功能。有学者发现，神经酰胺的减少可引起皮肤功能异常，瘙痒类皮肤病患者的干燥皮损中神经酰胺的含量明显低于正常皮肤[6]。FLG是表皮颗粒细胞角质透明蛋白颗粒的主要成分，有发现证实它的基因编码突变会导致一些以皮肤干燥和皮肤屏障功能受损的疾病，如特应性皮炎(atopic dermatitis，AD)和寻常型鱼鳞病、银屑病[7]等。Caspase14不但可以促进表皮细胞终末分化，并且在角质层水合作用中发挥关键催化作用，以维持皮肤屏障的稳态，Caspase14的表达变化在皮肤老化及银屑病等皮肤病中发挥重要的作用。

注：a:模型组(×200)；b: 模型组(×400)； c: 核桃青皮流浸膏低剂量组(×200)； d: 核桃青皮流浸膏低剂量组(×400)； e: 核桃青皮流浸膏中剂量组(×200)； f: 核桃青皮流浸膏中剂量组(×400)；g：核桃青皮流浸膏高剂量组(×200)；h：核桃青皮流浸膏高剂量组(×400)；i：阳性药组(×200)；j：阳性药组(×400)；k：假手术组(×200)；l：假手术组(×400)。

图2各组Balb/c鼠皮肤组织的变化

表3 各组Balb/c鼠皮肤组织中AQP3、Cer、FLG、Caspase14的基因表达

注：与假手术组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01；与阳性药组比较，cP<0.01。

本实验研究结果显示：给药10天后，阳性药及各浓度核桃青皮流浸膏治疗组较模型组皮损部位红肿程度轻、鳞屑面积小，皮肤较光滑，增厚程度轻，尤其核桃青皮流浸膏高剂量组及阳性药组较假手术组无显著性差异(P>0.01)，证明有明显的改善作用。通过皮肤组织病理学检测可知，模型组镜下表皮增厚伴角化过度及角化不全，棘层增厚，部分表皮突延长，真皮乳头水肿伴血管扩张，血管周围见少量淋巴细胞及中性白细胞浸润，部分区域可见Munro微脓肿，部分区域可见表皮溃疡形成，符合银屑病的典型病理改变，不同浓度的核桃青皮流浸膏均可改变咪喹莫特乳膏致银屑病模型的皮损状况。与假手术组相比，模型组皮肤组织中的AQP3、Cer、FLG、Caspase14表达明显下降(P<0.01)，表明AQP3、Cer、FLG、Caspase14参与银屑病的病理改变，给予不同浓度的核桃青皮流浸膏后基因表达有不同程度的增强，表明核桃青皮流浸膏对咪喹莫特乳膏致银屑病小鼠模型病理的变化有改善作用；核桃青皮流浸膏中、高剂量组AQP3、Cer、FLG、Caspase14表达分别与模型组比较均具有显著性差异(P<0.01)，核桃青皮流浸膏低剂量组FLG、Caspase14的表达较模型组却无显著性差异(P>0.01)，且核桃青皮流浸膏高剂量组与阳性药组相比，四种物质的表达均不具有显著性差异(P>0.01)，这表明不同浓度核桃青皮流浸膏对受试皮肤损伤确实有改善作用，且与给药量成线性关系，其中对AQP3、Cer表达的影响可能更为敏感。

综上所述，核桃青皮流浸膏对咪喹莫特乳膏致银屑病小鼠模型病理的变化有改善作用，其增强皮损组织中AQP3、Cer、FLG、Caspase14四种相关保湿因子的表达是改善皮肤损伤的可能机制之一，该结果为进一步探究核桃青皮治疗银屑病和预防复发提供了理论依据，是否还具有其他作用机制有待于进一步探究。