结肠癌T-cadherin表达水平分析与5-Aza-CdR对其表达和结肠癌细胞增殖、侵袭及凋亡的影响

福建医科大学附属第二医院肿瘤外科，福建 泉州，362000

结肠癌是临床常见恶性肿瘤之一，2018年全球约有110万新发病例，死亡人数约为55万多人［1］。而在中国结肠癌也是最常见的胃肠道恶性肿瘤［2］。尽管结肠癌的总体疗效有所改善，但预后仍然不能令人满意。近年来，随着全基因组及全外显子测序技术的发展，新的癌症基因或抑癌基因不断被发现，并由此衍生出新的基因治疗方案，改善了患者的疗效及预后。但由于基因组学的复杂性及多样性，目前仍无法完全揭示肿瘤的发生、发展机制。因此发现新的肿瘤调节因子并揭示其内在的机制，在肿瘤治疗的研究中仍尤为重要。

T钙黏蛋白（T-cadherin），也称钙黏蛋白13（CDH13），是cadherin超家族的一个非典型成员，它通过糖基磷脂酰肌醇锚定在细胞膜上［3］。其常在各种类型的癌症中低表达，包括胃癌［4］、乳腺癌［5］、肺癌［6］、结肠癌［7］、皮肤鳞状细胞癌［8］和其他类型的癌症［9］。大量研究提示，T-cadherin作为一种抑癌蛋白具有潜在的意义，因此揭示其在结肠癌中的作用，有助于发现结肠癌治疗的新靶点。故本研究通过收集临床样本，在mRNA表达和蛋白水平上，分析T-cadherin的表达变化及其与患者临床病理学特征的关系，进而利用药物5-Aza-CdR处理人结肠癌细胞系HT-29，分析其对T-cadherin表达和HT-29细胞生物学行为的影响，初步阐明T-cadherin在结肠癌中的调控机制。

1 材料和方法

1.1 临床样本和细胞系

收集福建医科大学附属第二医院2015—2016年40例手术切除的结肠癌组织及癌旁组织新鲜样本，并经过病理学检查验证。患者包括例31例男性和9例女性，手术前均未接受放疗或者化疗。所有患者均被告知样本的用途并同意。取下的组织用PBS缓冲液冲洗2遍，立刻放置于液氮中保存及运输，用于总RNA提取及蛋白提取。HT-29细胞系购买自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。人结肠癌HT-29细胞培养基为DMEM完全培养基（含10%胎牛血清和1%双抗）（美国Thermo公司），在37 ℃、CO2体积分数为5%的条件下培养。细胞实验分为未处理组和5-Aza-CdR药物处理组。细胞药物处理：采用0.25%的胰酶消化HT-29细胞，结合移液器吸嘴吹打，使细胞充分悬浮，加入含血清培养基终止消化，将细胞分装至6个培养瓶中，加入DMEM完全培养基，置于细胞培养箱中培养24 h，换液，向其中3瓶加入5 μmol/L 5-Aza-CdR（美国Sigma公司），以不加药物者为对照组，每天换液，药物处理3 d后收集细胞。

1.2 实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）

TRIzol试剂购自宝生物工程（大连）有限公司，参照其说明书，提取组织及细胞的总RNA。通过ND-1000分光光度计（美国Thermo公司）检测RNA的浓度和纯度，确保D260nm/D280nm＞2.0，D230nm/D260nm＞1.8。采用RevertAid逆转录酶（美国Thermo公司）将RNA逆转录为cDNA。按照2×SGExcel FastSYBR Mixture［生工生物工程（上海）有限公司］说明书，配制RTFQ-PCR反应体系（25μL2×SGExcel FastSYBR Mixture+1 μL 上游引物+1 μL下游引物+1 μL cDNA，加入超纯水补齐至50 μL），上机检测（StepOnePlus™RTFQ-PCR仪，美国ABI公司），反应程序为：预变性95 ℃，20 s；变性95 ℃，3 s；退火/延伸60 ℃，30 s；35个循环。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。T-cadherin上游引物为5'-GATGTTGGCAAGGTAGTCGAT-3'，下游引物为5'-GCTCCCTGTGTTCTCATTGAT-3'。以GAPDH作为内参。GAPDH上游引物为5'-ACGGGAAGCTTGTCATCAATGG-3'，下游引物为5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTGG-3'。根据2-ΔΔCT计算T-cadherin的相对表达量。

1.3 蛋白质印迹法（Western blot）检测

离心收集细胞，采用1×RIPA裂解液（美国Sigma公司）裂解细胞，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒［生工生物工程（上海）有限公司］对蛋白定量。取50 μg蛋白样品与凝胶缓冲液混合，煮沸10 min，之后进行SDS-PAGE电泳。将蛋白转移至硝酸纤维素膜（美国Millipore公司）上。非特异性抗体采用含有5%脱脂牛奶的1×Tris缓冲液封闭，室温下温育2 h。在4 ℃下，膜与T-cadherin抗体或GAPDH抗体（美国OmnimAbs公司）在含有5%脱脂牛奶的1×TBS缓冲液中温育过夜。采用1×TBS洗涤3次后，膜与辣根过氧化物酶标记的兔IgG抗体（美国OmnimAbs公司）在室温下温育2 h。在Fluor Chem Systems下（美国ProteinSimple公司）观察结果，采用系统自带的软件（Alpha View Software）分析目标蛋白的相对水平。

1.4 细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）分析细胞增殖

采用CCK-8试剂盒［东仁化学科技（上海）有限公司］分析细胞的增殖。在96孔板中，在每孔中接种5×103个细胞，总培养液体积为100 μL，每组设置5个复孔。在铺板后的1、2、3和4 d共4个时间点，分别向细胞中加入10%的CCK-8试剂，放置于37 ℃中温育2 h。将96孔板放在ELx808酶标仪（无锡百泰克生物技术有限公司）中进行检测。读取并记录每孔在450 nm的吸光度（D）值。

1.5 Transwell检测细胞侵袭能力

采用Transwell小室（美国Corning公司）分析细胞的侵袭，首先采用Matrigel基质胶（美国BD公司）包被小室。采用OPTI-MEM无血清培养基悬浮细胞并计数，取1×105个细胞加入上室，补齐OPTI-MEM无血清培养基至终体积为200 μL，下室加入700 μL含20%小牛血清的DMEM培养基。培养板放在37 ℃、CO2体积分数为5%的细胞培养箱中培养24 h。次日，取出上室，去除培养基，用PBS洗涤2次，移入含800 μL甲醇的孔中固定30 min。去除固定液，加入0.1%结晶紫染色20 min。PBS冲洗小室后将其放在显微镜下观察，随机取9个视野，拍照。

1.6 细胞凋亡

采用购自江苏凯基生物技术股份有限公司的AnnexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒分析细胞凋亡。胰酶消化悬浮不同处理组的细胞，300×g离心5 min收集细胞。将细胞与PI与AnnexinⅤ试剂在室温下避光温育15 min，上流式细胞仪检测（Guava easyCyteTM，美国Millipore公司）。

1.7 统计学处理

采用GraphPad Prism 5软件进行统计分析。通过t检验分析不同组别之间的差异。所有实验至少重复3遍。结果以表示。用t检验和单因素方差分析评估T-cadherin表达与结肠癌患者临床病理参数之间的关系。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 T-cadherin在结肠癌组织中的表达及其与临床病理学特征的关系

采用RTFQ-PCR技术分析T-cadherin在结肠癌组织中的mRNA表达水平。如图1和表1所示，T-cadherin在结肠癌组织中mRNA的表达水平显著低于癌旁组织（t=12.61，P＜0.000 1）。Western blot检测结果进一步表明，T-cadherin蛋白在结肠癌组织中的水平也明显下降（t=4.602，P＜0.05，图2）。T-cadherin的mRNA表达和结肠癌患者临床病理学特征关系分析显示，其mRNA表达水平与淋巴结转移（F=5.316，P=0.009 3）及分化程度（F=5.807，P=0.006 4）明显相关，而与其余病理变量（包括性别、年龄、肿瘤大小和肿瘤浸润深度）无明显相关（表2）。

图1 结肠癌组织及癌旁组织中T-cadherin mRNA的表达分析Fig.1 Analysis of T-cadherin mRNA expression in colon cancer tissues and paracancerous tissues

表1 T-cadherin在结肠癌组织和癌旁组织的mRNA表达Tab.1 The mRNA expression of T-cadherin in colon cancer tissues and paracancerous tissues

图2 结肠癌组织及癌旁组织中T-cadherin 蛋白水平的分析Fig.2 Analysis of T-cadherin protein level in colon cancer tissues and paracancerous tissues

表2 T-cadherin mRNA表达与结肠癌患者临床病理特征的关系Tab.2 Relationship between T-cadherin mRNA expression and clinicopathological features of patients with colon cancer

2.2 5-Aza-CdR对T-cadherin表达的影响

采用甲基化抑制剂处理细胞后，分别通过RTFQ-PCR和Western blot检测T-cadherin在细胞中的表达变化。结果发现，抑制甲基化后，T-cadherin在转录水平（图3）和翻译水平上（图4）的表达均发生明显上调。

2.3 T-cadherin与HT-29细胞增殖、侵袭和凋亡之间的关系

CCK-8实验表明，与空白对照组相比，药物处理后，HT-29细胞增殖受到明显的抑制（图5）。Transwell实验结果表明，5-Aza-CdR干预组的细胞侵袭能力明显下降（图6）。流式细胞术分析结果发现，5-Aza-CdR处理可以明显提高肿瘤细胞的凋亡，凋亡率可以达到30%（图7）。

图3 5-Aza-CdR处理后细胞T-cadherin mRNA表达变化Fig.3 Changes of T-cadherin mRNA expression in cells treated with 5-Aza-CdR

图4 5-Aza-CdR处理后，细胞T-cadherin 蛋白表达变化甲基化抑制剂处理后，细胞中T-cadherin 蛋白水平明显上调Fig.4 Change of T-cadherin protein expression in cells treated with 5-Aza-CdR

图5 CCK-8分析5-Aza-CdR对HT-29细胞增殖的影响Fig.5 CCK-8 assay the effect of methylation inhibitor on the proliferation of HT-29 cells

图6 Tranwell分析5-Aza-CdR对HT-29细胞侵袭的影响Fig.6 Tranwell assay showed the effect of 5-Aza-CdR on the invasion of HT-29 cells

图7 流式细胞术分析5-Aza-CdR对HT-29细胞凋亡的影响Fig.7 Flow cytometry was used to analyze the effect of 5-Aza-CdR on the apoptosis of HT-29 cells

3 讨 论

结肠癌是常见恶性肿瘤之一，死亡率居所有癌症第五位［1］，揭示其内在的发生、发展机制对于结肠癌患者的治疗意义重大。近年来基因组学的快速发展，已经逐渐成为癌症研究的一个重要领域。因此发现结肠癌新突变基因，将有助于机制的探讨及治疗的改变。

钙黏蛋白是细胞表面跨膜蛋白的一个超家族，传统上分为经典钙黏蛋白和非经典钙黏蛋白［10］。早有研究报道了钙黏蛋白在肿瘤中的作用，如E-cadherin，是肿瘤中潜在的抑制因子［11］。然而，某些钙黏蛋白也被认为是促癌蛋白，如P-cadherin［12］和N-cadherin［13］。T-cadherin是钙黏蛋白超家族的一个非典型成员，是目前已知的唯一一种通过GPI锚定而非跨膜结构域膜锚定的钙黏蛋白［14］。人类T-cadherin的基因在几种类型的癌症中均发生沉默，长期以来被认为具有抗癌作用［15］。已有研究表明，T-cadherin可能抑制肿瘤的发展，包括肿瘤细胞增殖、侵袭和微血管生成，这一过程涉及多个信号转导通路，包括Akt和SET7/9-p53信号通路［16-17］。但T-cadherin在结肠癌发病机制中的作用研究尚少，因此，揭示T-cadherin在结肠癌中的作用具有重要意义。

钙黏蛋白已被鉴定为多种癌症中的肿瘤抑制基因。Wang等［18］研究发现来自前列腺癌转移的细胞系DU145中T-cadherin的外源性表达降低了致瘤性，而来自良性前列腺增生的BPH1中T-cadherin转录的敲低促进了肿瘤发生；Wei等［19］研究发现下调T-cadherin的表达可能有助于胃癌进展；Kong等［5］研究发现T-cadherin低表达的腋窝淋巴结阳性乳腺癌患者的预后较差。在本研究中，我们对40例结肠癌样本进行了分析，发现T-cadherin在结肠癌组织中的表达显著低于癌旁正常组织，其表达水平与淋巴结转移和分化程度明显相关，提示T-cadherin异常表达在结肠癌的发生、发展中可能发挥抑癌作用。

T-cadherin的表达变化也与T-cadherin基因启动子区域的甲基化水平有关。DNA甲基化是真核生物关键的表观遗传修饰之一，参与了microRNAs表达的调控［20］和基因选择性剪接［21］。异常DNA甲基化常使T-cadherin在癌症中呈现低表达，并且促进肿瘤的发生、发展，如肺癌［22］、膀胱癌［23］、鼻窦癌［24］、食管癌［25］。异常DNA甲基化在结直肠癌的发生过程中起着重要的作用［26］。最近一项Meta分析结果表明，T-cadherin基因甲基化在结肠癌的发生、发展中起重要作用［27］。5-Aza-CdR可在体内外重新上调因高甲基化状态而沉默的抑癌基因，导致细胞分化和凋亡，从而抑制肿瘤进展［28］。本研究采用甲基化抑制剂5-Aza-CdR成功上调T-cadherin的表达，通过细胞生物学行为观察发现5-Aza-CdR药物处理与结肠癌细胞的增殖和侵袭的抑制及诱导凋亡密切相关，提示5-Aza-CdR可通过抑制T-cadherin甲基化逆转T-cadherin表达下调，并抑制结肠癌细胞的增殖、侵袭和抗凋亡。相关研究已报道了T-cadherin水平上调对癌细胞行为的影响，如T-cadherin的重新表达减少了人类前列腺癌［18］、黑色素瘤［29］、乳腺癌［30］和肝细胞癌细胞系［31］的恶性特性等。但T-cadherin去甲基化影响结肠癌发展的作用机制仍需进一步研究。

本研究结果证实，T-cadherin在结肠癌组织中呈低表达，甲基化抑制剂处理可上调T-cadherin表达，并且抑制肿瘤细胞增殖和侵袭能力，促进细胞凋亡。本研究结果提示，T-cadherin在结肠癌中发挥抑癌基因作用，并且可能是结肠癌患者使用DNA甲基化抑制剂进行治疗的靶点。