益生菌阿胶低肽复合乳饮料调配工艺

刘星，秦楠，李冠文，刘键辉，叶丹莹，曹华麒

（山西中医药大学制药与食品工程学院，太原030619）

0引言

阿胶富含有明胶、蛋白质等多种有效成分，有增强免疫、抗疲劳、抗辐射等作用[1-2]。红枣具有安神健脾、补肾等多种保健食疗功能，一直以来被人们视为极佳滋补品[3-4]。韩雪等利用乳酸菌发酵红枣汁发现，游离态酚酸含量显著提高并表现出较强的抗氧化活性[5]。黑枸杞具有提高免疫、抗氧化、滋肝等功能[6]。杨洁与梁小军分别从黑枸杞中提取总黄酮、多糖物质，其抗氧化与免疫活性显著提高[7-8]。林燕文等对乳酸菌发酵枸杞泡菜研究发现，枸杞多糖可为乳酸菌提供碳源，提高产酸速度与产酸力[9]。基于阿胶低聚肽的研究，以牛奶、阿胶低肽粉、红枣与黑枸杞液为发酵基液，优化了复合乳饮料的配方，并对稳定性进行了研究，为药食同源原料的开发利用提供了一定的科学依据。

1实验

1.1材料与仪器

红枣，黑枸杞，阿胶，阿胶低肽粉（低肽质量分数为58%）（实验室自制）；双歧杆菌（Bifidobacterium）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）∶嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)=1∶1；胃蛋白酶1×105 U/g，胰蛋白酶1×104 U/g，木糖醇，柠檬酸，复合香精（菠萝香精：桔子香精=1∶1），瓜尔胶，黄原胶，蔗糖酯均为食用级。

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1.2方法

1.2.1工艺流程

1.2.2操作要点

（1）阿胶低肽粉的制备。阿胶粉用超声波辅助胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解，酶解条件为加酶量分别0.02 g、0.05 g，先后调节温度45℃和42℃，p H值为2.0和8.0，时间2.5 h和3.5 h，酶解后将酶解液于100℃灭酶10 min，然后置于旋转蒸发仪中，55℃浓缩至原体积的30%左右，冷冻干燥后即得阿胶低肽粉。

（2）复合发酵液的制备。以牛奶、阿胶低肽粉、红枣和黑枸杞液为主原料，用双歧杆菌与传统乳酸菌作为发酵菌种，发酵工艺为牛奶、红枣汁与黑枸杞汁体积比40∶20∶10(mL)，加水补足至100 mL，按5 g/100 mL添加阿胶低肽粉，菌种复配比（益生菌∶传统乳酸菌=1∶1），接种量3%，蔗糖添加量2 g/100 mL，发酵温度37℃，时间6 h。

（3）阿胶低肽复合乳饮料的制备。将复合发酵液用高速搅拌器搅拌破乳10 min，加入木糖醇、柠檬酸、及复合香精等进行调配，并按一定比例添加稳定剂，在85℃条件下杀菌15 min，冷却后即得阿胶低肽复合乳饮料。

1.2.3阿胶低肽复合乳饮料调配的单因素实验

感官评分为评价指标，分别考察木糖醇、柠檬酸、蜂蜜及复合香精的添加量对复合乳饮料感官品质的影响，不同因子梯度条件如表1所示。

表1单因素水平设计

1.2.4复合乳饮料响应面优化实验

基于单因素试验结果，选用中心组合实验Box-Behnken设计方案，选取木糖醇、柠檬酸、复合香精添加量3个变量，以A，B，C表示；并以+1，0，-1分别代表其变量的水平，按方程x=(X-X 0)/△X对自变量进行编码。其中，x为变量的编码值；X为变量的真实值；X 0为实验中心点变量的真实值；△X为变量的步长变化；感官评分Y为响应值，如表2所示。

1.2.5感官评价标准

表2响应面实验因素水平编码 g

复合乳饮料感官评价依据中华人民共和国标准GB/T21732-2008《含乳饮料》及相关文献[10-11]，请20位均接受过《食品感官分析》课程培训的专业技术人员，按照表3感官评分标准进行评价，具体评分标准如表3所示。

表3复合乳饮料感官评分标准

1.2.6正交优化稳定性实验

根据单因素试验结果，以感官评分为评价指标，选择瓜尔胶添加量（A）、黄原胶添加量（B）、蔗糖酯添加量（C）为主要因素，采用L 9（33）正交试验设计，对各因素水平进行优化，正交试验因素与水平如表4所示。

表4复合乳饮料稳定性正交试验因素与水平 g

1.2.7阿胶低肽复合乳饮料稳定性的评价标准

复合乳饮料属多相体系，成分复杂，稳定性是影响产品的主要因素[12-13]。将稳定剂溶于热水充分溶解后，与复合乳饮料按一定比例混匀，静置24 h后观察稳定性，并对复合乳饮料的沉淀、乳清析出以及脂肪上浮等情况进行评价，满分100分，具体评分标准如表5所示。

1.3理化及微生物指标测定

利用芦丁、葡萄糖作为标品，采用分光光度法对黄酮[14]及多糖[15]质量分数进行测定；凯式定氮法测定蛋白质质量分数[16]。

活菌数的测定：采用国标GB 4789.35-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》中乳酸细菌培养基（MRS）培养基的方法对益生菌复合乳饮料乳酸菌数量进行检测，将样品涂布接种到MRS培养基中，37℃下培养48 h后，计数[17]。

大肠菌群的测定：采用国标GB 4789.3-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》中平板计数的方法对益生菌复合乳饮料的大肠杆菌数量进行检测，将样品倾注接种到结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)培养基中，37℃下培养48 h后,计数[18]。

1.5数据分析

表5复合乳饮料稳定性的评分标准

本研究所有的试验数据均使用Origin和Design-Expert（version8.0.6）统计软件进行数据处理，运用最小差异显著法（LSD）进行差异显著性检验。

2结果与分析

2.1阿胶低肽复合乳饮料单因素实验

2.1.1木糖醇添加量对复合乳饮料感官质量的影响

如图1所示，随木糖醇添加量的增加，感官评分呈先升后降的趋势，由于木糖醇的增加，甜度增大导致饮料过甜，逐渐出现酸甜比不协调。因此，木糖醇添加量选择4 g/100 mL为宜。

图1木糖醇添加量对感官质量的影响

2.1.2柠檬酸添加量对复合乳饮料感官质量的影响

如图2所示，随柠檬酸添加量的增加，感官评分先增大后减少，饮料酸味逐渐增大，当添加量大于0.15 g/100 mL时，评分呈下降趋势，可能是过酸造成口感失调，因此，柠檬酸添加量选择0.15 g/100 mL为宜。

图2柠檬酸添加量对感官质量的影响

2.1.3蜂蜜添加量对复合乳饮料感官质量的影响

如图3所示，感官评分随蜂蜜添加量的增加呈逐渐增大而后下降趋势，当添加量为8 g/100 mL时达到最高，在此条件下，乳饮料香甜不腻，继续添加蜂蜜，蜂蜜的味道会掩盖其他风味，表现出适度过高。因此，蜂蜜添加量选择8 g/100 mL为宜。

2.1.4复合香精添加量对复合乳饮料感官质量的影响

图3蜂蜜添加量对感官质量的影响

如图4所示，感官评分随着复合香精添加量的增加呈先上升再下降的趋势，香味由淡逐渐突出，但当添加量超过0.06 g/100 mL时，香精味浓厚，口感较差，因此，复合香精添加量选择0.06 g/100 mL为宜。

图4复合香精添加量对感官质量的影响

2.2复合乳饮料响应面试验结果

2.2.1响应面试验设计与结果

如表6所示，17个试验点中12个是析因点，5个是零点，析因点是自变量取值在X 1，X 2，X 3所构成的三维顶点，零点表示区域的中心点，其中重复零点实验5次，用以估算试验误差。

2.2.2模型的建立及其显著性检验

利用Design-Expert（version8.0.6）软件对表3试验数据通过多元回归拟合，得到阿胶低肽复合乳饮料的感官评分（Y）对自变量木糖醇添加量（A）、柠檬酸添加量（B）、复合香精添加量（C）的回归方程为

Y=93-1.5A-0.25B-2.5C+1.5AB-3.0AC+4.5BC-5.25A2-8.75B2-7.25C2。

由表7可以看出，模型F值为25.31，P＜0.0001，说明此模型极显著，模型失拟项表示模型预测值与实际值不拟合的概率，此模型失拟项P=0.5645＞0.05，表明模型不显著，拟合概率高，运用到试验中误差小。该模型的相关系数R 2=0.9702，且模型的调整确定系数R2Adj=0.9319，说明此模型能用于93.19%的试验结果解释，进一步说明了回归方程的拟合程度较好。

由表7中的F值的大小可以判断各因素对益生菌复合发酵乳饮料质量影响的强弱，F值越大，说明该因素对于感官评价的影响程度越大。故根据上表可得出各因素对于复合乳饮料感官评价的影响程度大小依次为复合香精添加量（C）＞木糖醇添加量（A）＞柠檬酸添加量（B）。

表6 Box-Behnken实验设计及结果

根据上述回归方程绘制出响应面图，以确认复合香精、木糖醇、柠檬酸添加量3个因素对复合乳饮料质量的影响，如图5所示。

图5（a）所示，木糖醇-柠檬酸添加量对复合乳饮料感官评分的交互作用不显著。随着两者添加量逐渐增加，感官评分先增大然后减小。由图5（b）所示，木糖醇-复合香精添加量对感官评分的交互作用显著（P＜0.05）。由图5（c）所示，柠檬酸-复合香精添加量对感官评分的交互作用极显著（P＜0.01），通过响应面

图5各因素交叉作用对复合乳饮料的感官评分影响的响应面和等高线

表7回归模型方差分析

分析，响应面的坡度较陡。感官评分随着两者的提高而增加，当柠檬酸达到0.16 g、复合香精达到0.07 g时增长趋势变缓，开始呈现下降的趋势。

2.2.3验证实验

通过Design-Expert 8.0.6软件分析，最佳的制备工艺条件为木糖醇添加量1.96 g，柠檬酸添加量0.166 g，复合香精添加量0.076 g，在此条件下的感官评价得分为93.5分。考虑实际操作的方便性，将最适参数修正为：木糖醇添加量2 g，柠檬酸添加量0.15 g，复合香精添加量0.08 g，为了验证模型预测的准确性，重复实验3次，所得平均值与理论预测值非常接近，且相对误差小于2%，无显著性差异（P＞0.05），说明重复性良好。

2.3正交优化稳定性实验结果

由表8可以看出，各因素对感官影响的主次顺序为C＞B＞A，即蔗糖酯的添加量复合乳饮料的稳定性影响最大，依次是黄原胶、瓜尔胶添加量，最优组合为A 1B2C 3，即瓜尔胶添加量为0.04 g/100 mL，黄原胶添加量为0.08 g/100 mL，蔗糖酯添加量为0.3 g/100 mL。在此最佳条件下，产品的感官评分为91分。由表9可知，因素A，B，C对稳定性评分的影响均有显著性差异（P＜0.05）。

表8复合乳饮料调配优化正交实验结果

表9正交实验结果方差分析

2.4储藏期内益生菌复合乳饮料活菌数的变化

由图6可以看出，益生菌复合乳饮料中活菌总数随着储藏时间的延长，在2～4 d期间菌数增长量大、增速快，随着储藏时间延长菌数逐渐下降，这可能与菌体代谢产物大量积累形成的酸性环境对其菌体本身产生抑制，或与菌体进入老化、衰亡期导致负增长有关[17]。

2.5产品质量评价

图6储藏期内益生菌复合乳饮料活菌数的变化

2.5.1感官指标

色泽：均匀一致，浅褐色。组织状态：细腻、均匀，允许有少量乳清析出。滋味：酸甜适口，口感丝滑，有酸奶香气，有清爽的红枣与黑枸杞味，无异味。

2.5.2理化指标

黄酮质量分数为0.54%，多糖为9.32%，蛋白质质量浓度为2.2±0.13 g/100 mL。

2.5.3微生物指标

乳酸菌总数为3.6×107 mL-1；菌落总数＜100 mL-1；大肠菌群（最近似值）≤3 mL-1；致病菌未检出。

3结论

牛奶、红枣汁与黑枸杞液体积比40∶20∶10(mL)，添加阿胶低肽粉5 g/100 mL的基础上，通过单因素和响应面试验确定了益生菌发酵复合乳饮料的最佳配方：木糖醇2 g/100 mL，柠檬酸0.15 g/100 mL，复合香精0.08 g/100 mL，蜂蜜8 g/mL。稳定性作为影响生产的主要因素之一，在原料配比最优基础上，采用添加复配的稳定剂的方式可有效防止出现分层、沉淀等现象。通过稳定性实验，选择瓜尔胶0.04 g/100 mL，黄原胶0.08 g/100 mL，蔗糖酯0.3 g/100 mL。通过测定复合乳饮料理化指标与微生物指标，黄酮质量分数0.54%，多糖9.32%，蛋白质质量浓度2.2 g/100 mL。乳酸菌总数为3.6×107 mL-1，菌落总数＜100 mL-1，致病菌未检出。终制得的成品具有独特风味，酸甜适宜，口感佳稳定性好的保健乳饮料。

通过乳酸菌发酵，红枣中游离酸酚、黄酮类物质含量可显著提高，具有较强的抗氧化活性，结合黑枸杞多糖抗氧化活性及增强免疫力活性，后期可通过动物模型对产品的功能活性进一步验证。