基于网络药理学探讨三叶糖脂清治疗2型糖尿病的作用机制*

晏一淇 ，黄 明 ，于亚君 ，李 霖 ，胡 珍 ，韩国英 ，张 晗

（1．天津中医药大学中医药研究院，天津 301617；2．天津中医药大学第一附属医院，天津 300381）

糖尿病是一种以血浆葡萄糖水平升高为特征的内分泌代谢紊乱疾病，是临床常见的慢性病[1]。2017年全球约有4．25亿糖尿病患者，中国约有1．18亿，占全球27%，居全球首位[2]。糖尿病人群中约90%的患者为2型糖尿病（T2DM）[3]。T2DM是由胰岛素调控葡萄糖代谢能力下降并伴随胰岛β细胞功能缺陷所导致的胰岛素分泌减少而引起的脂肪、碳水化合物和蛋白质代谢异常，以血糖异常为主要特征的内分泌代谢性疾病[4]。

中医学认为T2DM属“消渴病”范畴，其基本病机为虚、瘀、痰、浊互结，其中瘀、痰、浊均属内生之毒，内生之毒郁而化热，造成热毒郁结、耗伤[5]。三叶糖脂清来源于临床经验方，由桑叶、荷叶、丹参、赤芍和山楂叶5味中药组成，具有升清降浊，化痰除痞的功效[6]。研究表明糖脂清可以治疗T2DM[7]。但目前对三叶糖脂清治疗T2DM的主要有效成分、作用靶点和机制尚未明确。

本研究整合已发现的三叶糖脂清的化学成分，基于计算机和生物信息技术，筛选三叶糖脂清的活性成分，构建三叶糖脂清的“多成分-多靶点-多途径”的网络模型，探索三叶糖脂清影响T2DM的潜在基因与相关信号通路，为揭示其治疗T2DM的物质基础和作用机制提供了预测信息。

1 方法

1.1 筛选三叶糖脂清活性成分 借助中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）运用药物动力学参数筛选算法分析，分别筛选三叶糖脂清中5味中药符合ADME条件的所有化学成分，即为三叶糖脂清的活性成分。TCMSP由中国药典注册的499种中药组成，含有29 384种成分，3 311个靶点和837种相关疾病，并对每个化合物提供了较全面的用于药物筛选和评价的药代动力学性质相关数据，主要有口服生物利用度（OB）、小肠上皮通透性（Caco-2）、类药性（DL）、血脑屏障通透性（BBB）、药物半衰期（HL）、溶解度和药物成药五原则等[8]。OB指的是药物的有效成分或活性基团被吸收到达体循环的速度与程度；DL指药物包含一些特定的功能基团或者具有与大多数药物相同或相似的物理特征；BBB指的是药物成分可透过血脑屏障的能力。这3个参数是药物动力学筛选过程中的常用参数。本文设置筛选符合（OB≥30%、DL≥0．18、BBB≥-0．3）的化合物作为三叶糖脂清的活性成分。

1.2 预测三叶糖脂清相关靶点 得到三叶糖脂清的活性成分之后，继续在TCMSP中“Related Targets”下预测各个化合物成分所对应的靶点信息。部分活性成分未能搜集到对应靶点信息。再使用Perl语言结合uniprot数据库后台对应信息，将三叶糖脂清靶点名称转换为标准基因名。

1.3 预测T2DM相关靶点 在HPO数据库和Genecard数据库中以“T2DM”为检索词，连接数据库后台文献数据，获取T2DM的相关靶点，并用R语言“VennDiagram”程序包与三叶糖脂清相关靶点进行交叉对比得到重叠靶点。

1.4 构建三叶糖脂清活性成分-靶点网络 通过上文方法可获取三叶糖脂清的活性成分与重叠靶点。由于活性成分与靶点具有对应关系，使用Cytoscape 3．7．1软件，可绘制出三叶糖脂清活性成分-靶点网络图。

1.5 构建三叶糖脂清-T2DM重叠靶点蛋白互作网络（PPI） 将重叠靶点信息输入STRING数据分析平台，利用靶点之间作用关系的强弱构建三叶糖脂清PPI。将PPI网络信息以“TSV”格式导入Cytoscape 3．7．1中，对其进行互作网络拓扑分析，进行网络可视化处理并使用R语言进行统计，明确关键靶点。

1.6 京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析与基因功能分析（GO） 使用Perl语言结合DAVID生物信息数据库将重叠靶点名称全部转换为Entrez Gene ID，以供后续操作使用；使用R软件安装“colorspace”和“string”安装包，下载 R 语言的Bioconducor生物类程序包，如“DOSE”“clusterProfiler”和“pathview”。输入转换好的重叠靶点Entrez Gene ID，并运行R语言脚本进行KEGG通路富集分析和GO功能分析。

2 结果

2.1 活性化合物的筛选 根据 DL≥0．18、OB≥30%、BBB≥-0．3的原则，运用TCMSP检索到三叶糖脂清中活性化合物80个。见表1。

2.2 三叶糖脂清活性成分-靶点网络构建 活性成分-靶点网络共包括90个节点（node），见图1。图中红色节点代表化合物分子，共58个。绿色节点代表药物与疾病的重叠靶点，共30个。在网络分析中，节点的度数大小表示节点在网络中的重要程度。根据拓扑学性质筛选出度值较大的节点进行分析。在活性化合物中，β-谷甾醇和豆甾醇的网络度数较高。在之前的研究中已有文献报道β-谷甾醇和豆甾醇具有明显的降糖作用[9-10]。

2.3 PPI的构建 在HPO数据库和Genecard数据库中检索“Type 2 Diabete mellitus”，其中在 Genecard数据库中选取score值大于30的靶点。2个数据库共得到540个疾病靶点。与三叶糖脂清82个相关靶点重叠对比，得到30个重叠靶点信息，如图2A所示。对重叠靶点进行PPI网络构建，并根据拓扑分析统计连接度较高的靶点。图2B中，各个节点的颜色代表对应靶点的Degree值，颜色越趋近红色表示Degree值越高，越趋近绿色表示Degree值越低。图2C中对所有重叠靶点Degree值top20进行排序，由图可知白蛋白（ALB）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、胱天蛋白酶-3（CASP-3）的 Degree值较高，可能是三叶糖脂清影响T2DM时的潜在靶点。

2.4 KEGG富集分析 利用Perl语言将重叠的30个基因名称转换为Entrez Gene ID，使用R包的Bioconductor运算并导出KEGG通路富集筛选得到52条通路（P≤0．05），选择前20条通路信息绘制成图。涉及多种细胞凋亡、结肠癌和甲状腺激素等信号通路。见图3，颜色越趋近红色表示相关性越高。

2.5 GO富集 利用Perl语言将重叠的30个基因名称转换为Entrez Gene ID，使用R包的Bioconductor运算导出GO功能富集858条（P≤0．05），其中生物学进程（BP）共 776条、细胞组成（CC）25条和分子功能（MF）57条。分别选取前10条信息绘制成图。见图4。

3 讨论

本研究利用网络药理学的方法初步探索三叶糖脂清治疗T2DM的作用机制，从化合物-靶点图可知，三叶糖脂清中有80个活性化合物，活性成分对应有82个靶点，说明三叶糖脂清发挥药效具有多成分、多靶点的作用特点。

在三叶糖脂清的活性成分中，连接靶点数目最多的是β-谷甾醇和豆甾醇2个甾醇类化合物。药理学研究发现，β-谷甾醇能提高细胞中的酶和非酶抗氧化剂，使其具有有效的抗糖尿病、神经保护和化学保护作用[11]。在其他实验中能使高脂喂养的T2DM大鼠胰岛素水平恢复到正常水平[12]。豆甾醇是结构类似于胆固醇的植物甾醇，广泛存在于动植物中，在人体内可通过影响低密度脂蛋白来影响健康状况[13]。以往研究发现于豆甾醇具有抗氧化、降血糖和抑制甲状腺的作用[14]。

表1 三叶糖脂清中活性化合物的基本信息Tab.1 Basic information of active compounds in Sanye Tangzhiqing Tablet

图1 三叶糖脂清化合物-重叠靶点网络图Fig.1 Compound-overlapping targets network in Sanye Tangzhiqing Tablet

在活性成分-靶点网络中发现ALB、VEGFA、CASP-3的关联度较高。其中ALB是判定T2DM的重要指标，在T2DM患者体内，ALB的含量均较高[15]。血管内皮生长因子（VEGF）是一种肝素结合的同二聚体糖蛋白，在生理和病理条件下调节血管生成和血管通透性，VEGFA基因编码VEGF，位于6号染色体上，影响VEGF正常分泌，对T2DM及并发症有明显作用[16]。研究发现，在糖尿病大鼠的心肌细胞中CASP-3的水平比正常组水平高，高血糖诱导的氧化应激激活线粒体细胞色素C介导的CASP-3通路，从而诱导心肌细胞凋亡是糖尿病早期的主要细胞反应[17]。本研究得到540个T2DM靶点，在与三叶糖脂清相关靶点重叠对比之后得到30个重叠靶点，可认为是三叶糖脂清对T2DM起影响作用的潜在靶点。将30个重叠靶点通过KEGG通路富集，发现与T2DM相关的生物途径较多，富集在结肠癌、多种生物凋亡、丙型肝炎和甲状腺激素信号通路等途径上的相关性较高。T2DM患者易罹患结直肠癌，若接受胰岛素治疗，则不仅结直肠癌发病率更高，且肿瘤进展更加迅速。高胰岛素血症假说认为，异常增高的胰岛素及游离胰岛素样生长因子-1水平可促进结肠细胞增殖，最终导致结直肠癌的发生[18]。T2DM起病时以胰岛素抵抗为特征。持续的胰岛素抵抗导致胰腺β细胞功能障碍，在极端情况下导致β细胞凋亡[19]。研究表明乙型肝炎病毒（HBV）/丙型肝炎病毒（HCV）共感染与血糖水平显著相关。HBV/HCV共感染的参与者中有相当比例患上了T2DM。虽然HBV和HCV双重阳性感染的确切机制尚不清楚，但越来越多的证据表明HBV和HCV双重感染与T2DM的发展密切相关[20]；研究表明，甲状腺激素可改善糖尿病大鼠的胰岛素敏感性，并作为神经系统可塑性改变行为和认知功能的介质[21]。

图2 PPI的构建Fig.2 Construction of PPI

图3 三叶糖脂清与T2DM重叠靶点KEGG富集分析Fig.3 Enrichment analysis of KEGG on the overlapping target of Sanye Tangzhiqing Tablet and T2DM

图4 三叶糖脂清与T2DM重叠靶点GO功能富集Fig.4 GO functional enrichment of overlapping target of Sanye Tangzhiqing Tablet and T2DM

在GO功能富集中，发现重叠的76个靶点富集在1 068个BP、64个CC和111个MF上。将3个功能方面各取前10条信息绘制成图。76个重叠靶点在BP中富集在六大类，分别为神经系统发展、胆固醇代谢、对脂多糖反应、细胞凋亡执行、血管生成和对转录的调控。

CC中突触后膜突触膜的整体成分和突触后膜的组成成分关联较高；在MF中富集在类固醇结合、核受体活性和调节特异DNA结合的转录因子活性中较多。

4 结论

综上所述，本文运用网络药理学方法对三叶糖脂清的活性成分、作用靶点进行了筛选并对影响T2DM的作用途径进行了初步探究。根据网络筛选情况分析可知，在三叶糖脂清80个活性成分中隐丹参酮、花生四希酸、黄芩素、β-胡萝卜素、β-谷甾醇、丹参酮ⅡA、丹参酚醌、异丹参酮Ⅱ、鸢尾甲黄素和 丹 参 酮 Ⅵ 可 以 作 用 在 CCND1、CYCS、BCL2、GSK3β、CASP3、CTNNB1 和 ESR1 靶点从而激活结肠癌相关通路与甲状腺激素信号通路，对T2DM的病程产生影响。从结果中可以看出三叶糖脂清影响T2DM是通过多成分、多靶点、多途径的协同合作模式来发挥作用的。课题组后期将围绕物质基础-药效学评价-通路验证等方面开展实验研究，为三叶糖脂清影响T2DM以及后期的药物研究提供理论基础和实验数据。